! O/ F( J* c/ P& D; z1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
! H. B" y Q7 e& o2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
4 R" `8 `7 F: ?0 g8 q; V. s% ^3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4、每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
$ y5 Y. T& Z% u, S5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
5 U7 ]- ]( p7 ?, [6 U6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
玻璃杯机械设备
6 \6 v$ Z q8 k9 M7 F: d* r7 c! W! t7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2） 组织中总蛋白的提取：
, L# O0 r! M7 n, ?$ E+ b1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
1 `3 L/ y D- w$ H( ^/ @. w（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
9 G9 c( a' {& Y1 m! r2 j1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、弃上清，加入4ml PBS并用轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
; U9 D* x2 y) P% _0 ?1 [# R. c/ Y3、用洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4 x+ m5 T4 s1 R& B% t, I# x" m% S. X4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定
1 [) \, H4 I6 I0 k$ T" z（1） 制作标准曲线
1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
3、按下表在各管中加入各种试剂。
温度远程监控
5 E" l6 a" J7 F9 Q0μg 2.5μg 5.0μg 10.0μg 20.0μg 40.0μg
/ N/ c* [) b8 G1 U: V6 w9 i. e1mg/ml BSA － 2.5μl 5.0μl 10.0μl 20.0μl 40.0μl
0.15mol/L NaCl 100μl 97.5μl 95.0μl 90.0μl 80.0μl 60.0μl
) e2 J3 H9 L) I1 B ^9 q5 LG250考马斯亮蓝溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
9 s: x- M* A# z" A' z
; M$ t* _ t% ]0 B6 e1 e1 w5 f7 y4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比分析。
( D ]& e0 t! i. H* d3 R4 T虚拟试衣技术5、
. f( o0 |6 c5 E" f0 y: ]（2） 检测样品蛋白含量 1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将
空白倒入比杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比杯中按sample键测样品。
+ a; N# @, o6 h3 {注意：每测一个样品都要将比杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
: J& M% Q0 }7 a/ w( i2 Y4 j/ V（1） 清洗玻璃板：
3 K& P% q J- p一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再
9 ]# |, I: {) f9 {. g B用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2） 灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
1 m! G3 s- E0 Q% `+ ]! w2、配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
- T" M) T! D. @0 B" z' q3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
, }/ a: A7 v! U" c5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
6、 测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过20μl，加样孔的最大限度可加25μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
- L5 d$ r! A# I! n9 n: N: {' b（3） 电泳
! Y2 N- U s vb2y电泳时间一般1-2 h，电压为80较好，也可用100。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
自动排焊机" a r+ Z* \1 t0 }（四）转膜
（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
# e3 _5 @ F' `! d6 h（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
陶瓷灯头
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