Western-Blot 操作流程
母液
1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g＋蒸馏水200ml （用于上抗体后漂洗，一次配250ml）
溶解后，用浓盐酸(约15ml)调pH 至7.6，最后用蒸馏水定容至250ml，室温保存。此液体用来配置TBS缓冲液，用来漂洗上抗体后的膜 17.4mg/ml (100mmol/L)PMSF PMSF 0.174g＋异丙醇10ml溶后，分装1.5ml离心管，室温
0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4(MW119.98) 12g＋蒸馏水至500ml 溶解后，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO4·12H2O(MW 358.14) 71.6g＋蒸馏水至1000ml 溶解后，室温保存。
10％SDS SDS 10g＋蒸馏水至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺(AP) 过硫酸胺0.1g＋超纯水1.0ml溶解后，4℃保存，现配现用。(可先将干粉称好分量后放在EP 管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可)
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8) Tris (MW121.14) 45.43g＋超纯水200ml （用于做胶，一次配100ml）
溶解后，用浓盐酸调pH 至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8) Tris (MW121.14) 15.14g＋超纯水200ml （用于做胶，一次配100ml）
溶解后，用浓盐酸调pH 至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
90％Acr/Bic(37.5：1) 丙稀酰胺(Acr)玻璃加工工艺28.125g＋甲叉双丙稀酰胺(Bic)0.75g＋超纯水至100ml溶解后，一定要用滤纸过滤，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
使用液：
1.1M Tris-HCL 2.5ml 50mmol/l PH7.4gammaproteobacteria
2.Nacl 0.438g 150mmol/l
3.去氧胆酸钠 0.25％
4.NP-40 1%
5.EDTA 1mmol/l
―――――――――― 以上为总液，一次配50ml，4℃保存
6.PMSF 1mmol/l
7.Aprotinin 1ug/ml
配置时，先加入tris碱，用HCl调整pH值至7.4，然后在加入其他东西
玻璃毛细管
RIPA裂解液配方
1ml RIPA buffer contains 35μl proteinase inhibitor(sigma cat no P8340) and 10μl phosphatase inhibitor
RIPA buffer 最终浓度
1M Tris-HCl pH7.5) 5 ml 50mM
NaCl 0.87g 0.15 M
Na-deoxycholale 0.1g （1%）
三维网页0.5M EDTA(pH8.0) 0.8ml
NaF 41 mg
Nonidet P40 1 ml （1%）
Aprotinin10μg/μl 100μl 10μg/ml
加水到 100ml
Aprotinin 10μg/μl ；用10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用。
100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA) BSA 0.1g＋0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后-20℃保存。作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl 进行100 倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。 10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶(两块胶，10ml) 4％浓缩胶(两块胶，5ml)
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic(37.5：1) 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl(pH8.8) 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl(pH6.8) － 1.26ml
10％SDS 100 μl 50 μl
10%AP(过硫酸胺) 50 μl 25 μl
TEMED 5 μl 5 μl
加TEMED 后，立即混匀即可灌胶。(为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED 量加大，一般加至原来的2-3 倍，根据实验当时的温度适当调整)
10×的电泳液缓冲液 Tris(MW121.14) 15.15g
甘氨酸(MW75.07) 93.85g
SDS 5g
蒸馏水至 500ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5 次。
(电泳液配起来便宜，可不回收，配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10 倍使用，即取出50ml到烧杯，加入450ml双蒸水即可)
转移缓冲液 甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris(MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5 次(次溶液最好保存在4 度冰箱，最多使用5 次左右，不然影响转移效率。先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS 等比较困难，可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用)
10X 丽春红染液 丽春红S 2g
三 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。
10×的TBS 缓冲液 1 mol/L Tris·HCl(pH7.5) 50ml
NaCl 44g
蒸馏水至 500ml
(可以配制成10×TBS 缓冲液进行保存，稀释10 倍使用)
封闭液 脱脂奶粉(国产，光明牌) 5g+TBST 100ml 最好现用现配。
洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L β-巯基乙醇 700 μl （该液不需，除非一次检测几个抗体）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8) 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1 次。
抗体 用BSA 稀释至一定浓度使用，抗体不是浓度越高越好，一般一抗用中间的效价，二抗用1:40000。一抗用后可以回收液体，放在青霉素瓶子，4℃保存，可使用3次，二抗由于很便宜，可以弃之。
化学发光试剂ECL 是两瓶，棕瓶子，室温保存。买100圆/12.5ml，凌飞公司。不要搞混。用的时候，要换头，切切不可互相污染，否则失效！
操作步骤
(一) 蛋白样品制备
(1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的磷酸缓冲盐溶液PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上车载mp3播放器。
3、按1ml 裂解液加10 μl PMSF(100mM)，摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)
4、每瓶细胞加400 μl 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)微区扫描电化学工作站 也可刮下来后再放30分，期间开离心机预冷。
6、于4℃下12000rpm 离心5min(提前开离心机预冷)，完毕后敞开机盖子，擦干液体，然后关闭。
7、将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。大约可保存2个月，-70℃就相对时间长些。
(个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml 的细胞有时按照实验要求只能加100-200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl裂解液进行裂解，根
本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS(一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP 管中，这样可操作性就比较强)
(2) 组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml 匀浆器中球状部位，用干净剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 μl 单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。
蛋白提取的关键之处，是尽可能避免蛋白的降解。一般把组织匀浆后就直接放离心机4度12000g离心30min(省去了在冰上裂解的时间)，这样抽提效果更好。有一个特别注意的，组织抽提蛋白匀浆时，每次匀浆时间不要超过15秒，以尽可能不出现泡沫为好！！有钱的话，蛋白酶抑制剂推荐使用cocktail（鸡尾酒）。
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