当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 实验准备
一．器材
可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头
经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架
42℃恒温水浴
恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）
37℃培养箱
玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）
消毒过的洁净培养皿（直径10cm）
二．试剂
LB培养基
细菌培养用胰化蛋白胨 10g
细菌培养用酵母提取物 微波真空烧结炉5g
NaCl 5g
加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，
用5M NaOH（约0.2 mleva母）调节pH值至7.0，
smdv-17加水定容至1000 ml。
高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒安卓系统加速30分钟，
冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，
在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂, 即为含有琼脂的培养基
抗生素琼脂平板：待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存
pH试纸（或pH计）
IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，-20 ℃ 保存。
l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )，50 mmol / L DTT，2 % SDS (电泳级)，0.1 % 溴酚蓝，10 % 甘油
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 )酶溶法
(1)裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )，1 mmol / L EDTA，100 mmol / L NaCI
(2)50 mmol / L 苯(PMSF )
(3)10 mg / mL 溶菌酶
(4)脱氧胆酸
(5)1 mg / mL DNase I
2 )超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )，100 mmol / L DTT，4 % SDS，0.2 % 溴酚蓝，20 % 甘油
三．实验材料
重组质粒
感受态大肠杆菌
实验步骤
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌 50 ul
DNA 5 ul
轻轻混匀，静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，
筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。
2）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。
3）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。
4）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。
5）1200 rpm，离心2min，收集菌体。
6）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH 7.0），充分悬浮洗涤菌体。
7）12000 rpm，离心2min，收集菌体。
8）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。
加入900ul LB培养基，转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取转化重组质粒的单菌落接种至5ml 含有相应抗性的LB 培养基中，37℃，200 rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200 rpm 继续诱导培养，可以在2h，4h，6h分别取样以分析表达状况。
声波识别>去污水
将取出的1ml 菌液12000 rpm 离心1min，收集菌体，加入1ml PBS 缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。再加入300～500ml PBS重悬细胞。
取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
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