（改良J-G法）
【目的】
1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；
２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜不稳定的紫红偶氮胆红素在存在下转化为稳定的蓝偶氮胆红素，在600nm波长比，从标准曲线查总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】
试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】
1．试剂
称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入25.0g，搅拌使溶解（加入后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，
混匀。过滤后置棕瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液
称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液
称取亚硝酸钠0.5g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。若发现溶液呈淡黄，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液
称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂
临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．5.g/L叠氮钠溶液
7．胆红素标准液复方川羚定喘胶囊
（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小于0.04。 （2）配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶
液，在25℃条件下，光径1.000±0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系数应在60700±1600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74380±866。
（3）胆红素标准贮存液（171μmol/L）：
准确称取符合要求的胆红素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免产生气泡）。最后以稀释血请加至刻度。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4℃冰箱3天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。
【操作】
取试管3支，按下表操作：
表3-20 改良J-G法测定血清胆红素
加人物(m1)总胆红素管结合胆红素管空白管
血清0.20.20.2
苯甲酸
漂流河道设计1.6- 1.6
铸轧钠试剂
对氨基苯磺酸--0.4
重氮试剂0.40.4-
混匀，准确1分钟
叠氮钠-0.05-
苯甲酸- 1.55-
钠试剂
室温10分钟
碱性酒石酸钠 1.2 1.2 1.2
混匀，600nm波长比，以空白管调零，读取各管吸光度。从标准曲线上查出相应的胆红素浓度。
【标准曲线制作】
取试管6支，编号，按下表操作：
表3-21 胆红素标准曲线的绘制
加人物(m1)对照
12345
管
－0.40.8 1.2 1.6 2.0胆红素标准贮存
液体速凝剂液
稀释用血清 2.0 1.6 1.20.80.4-相当于胆红素浓
034.268.4103137171度（μmol/L）
混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。每一浓度做3个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。
【正常参考范围】
汤杯
血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L
血清结合胆红素（1分钟） 0～6μmol/L
【临床意义】
压缩空气过滤
血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。总胆红
素在17.1～34.2μmol/L时为隐性黄疸；超过34.2μmol/L时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性黄疸。
血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。溶血性黄疸时，血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的20%以下；肝细胞黄疸时，结合胆红素占总胆红素的35%以上；阻塞性黄疸时，结合胆红素升高更明显，占总胆红素的50%以上。
再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要由癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。
【结果及分析】
【思考题】
1. 简述血清胆红素测定的原理。
2. 血清胆红素测定中破坏氢键的组分是什么？
3. 肝细胞性黄疸时，血清中何种胆红素升高？
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