二、Bradford法
(一）、原理：
考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。 该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂
1、器材
A. 分光光度计
B. 微量加样器
C. 移液管、试管及试管架
D. 坐标纸
2. 试剂
（1）考马斯亮蓝G-250溶液：
称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）
精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(5) 层析样品
(三）、操作（标准曲线制作） ：
取7支试管按下表操作：
| 空白 | 待测 | 标1 | 标2 | 标3 | 标4 | 标5 |
标准蛋白 （ml） | | | 0.2 | 0.4 | 0.6 木薯干 | 0.8 | 1.0 |
待测样品2（ml） | | 0.2 | | | | | |
生理盐水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0.0 |
CBB-G250(ml) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
最终蛋白浓度（ug/ml） | 3.3 | 6.6 | 9.9 | 13.2 | 16.5 | |
|
| | | | | | | | |
混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线．
以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度
取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度
以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：
实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染法定量测定蛋白质的原理与方法
2. 熟练分光光度计的使用和操作方法烧录ic
【直埋电缆盖板实验原理】
此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红，当它与蛋白质结合后，变成蓝，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。
瓷管电阻器【器材与试剂】
后挂式耳机器材 1.可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等
试剂 1. 0.9%生理盐水
2. 考马斯亮蓝试剂
称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
3. 1000µg /ml蛋白质标准液
标准蛋白质溶液（1000ug/ml）：
精确称取100.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
【实验步骤】
1. 标准曲线的制作
(1) 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。
试 剂 | 试管编号 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
1000µg/ml标准蛋白溶液（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
0.9%生理盐水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | ctcs20.4 | 0.2 | 0 |
蛋白质含量（µg/0.1ml） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| | | | | | |
(2) 另取试管6支，吸取上述各管蛋白质溶液0.1ml，加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。
(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法（分组实际操作、讲解）
注意事项：(1) 持杯方法
(2) 一定要开盖调T 零点，盖盖调T 100
(3) 波长选择
(4) 空白杯所装的溶液
(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品提取液中蛋白质含量的测定
(1)蛋白质提取:称取样品约200mg，加蒸馏水5ml，匀浆，4000rpm离心10min，取上清液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离心10min，合并上清液并定容至10ml。
(2)蛋白质含量测定: 取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测 A595 值
(3) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。
3. 结果计算
样品蛋白质含量（µg/g鲜重）＝a (µg) ×提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）], a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg
【实验结果与分析】
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