一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用的制作方法

一种
β-1,3/
α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体为一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用。

背景技术：

2.β-葡聚糖是微生物、蘑菇和植物中广泛存在的一种多糖，它是组成高等植物、酵母菌和真菌细胞壁的结构大分子之一，β-葡聚糖活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数是通过β-1,3糖苷键结合，这是葡萄糖链连接方式。不同微生物来源的β-葡聚糖化学性质存在差异，因此会具有不同的功效，如青稞β-葡聚糖是青稞籽粒胚乳细胞壁的主要成分，具有降血脂、降胆固醇和预防心血管疾病等作用；酵母β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖，免疫增强活性更强，具有改善血脂、抗辐射和改善肠道功能的作用；燕麦β-葡聚糖是存在于燕麦胚乳和糊粉层细胞壁的一种非淀粉多糖，具有降低胆固醇、降血糖、增强免疫力、改善肠道和美容的功效。
3.近年来，有一些文献报道了以蔗糖为原料，经菌株发酵等工艺得到的β-1,3/α-1,3-葡聚糖，其多是应用于降低血糖、抗紫外线防晒或修复口腔粘膜损伤等方面，而对于β-1,3/α-1,3-葡聚糖在调节皮肤微生态中的作用却鲜有报道。
4.随着皮肤微生态学的兴起，利用现代生物技术研发出绿生态制剂以替代传统的抗生素、激素等药物，从根本上调整和维护皮肤的微生态平衡从而解决皮肤问题，成为新的发展方向。

技术实现要素：

5.本发明为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，本发明首次发现β-1,3/α-1,3-葡聚糖能够调节皮肤微生态，改善皮肤微生物菌平衡，调节皮肤物种多样性，并维持皮肤微生态的稳定性，维护皮肤健康。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用。
8.本发明中所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖的结构式为：
[0009][0010]
其结构通式为：
[0011]
聚-3)-β-d-吡喃-(l
→
3)-[β-d-吡喃-(l
→
3)-β-d-吡喃-]
3-(l
→
3)-α-d-吡喃-(l
→
3)-α-d-吡喃-(l
→
葡萄糖
[0012]
本发明所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖是经土壤杆菌zx09种子液发酵而来的，具体
地，所述β-1,3/α-1,3-葡聚糖按照以下制备方法获得：
[0013]
(1)将水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；
[0014]
(2)将步骤(1)所得的混合溶液的ph值调整至6.5～7.5，然后进行蒸汽灭菌；
[0015]
(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；
[0016]
(4)将土壤杆菌zx09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，调节通气流量至18～22l/min，搅拌转速250～270rpm，发酵温度设置为28～32℃，培养58～62h，发酵完成后得发酵液；
[0017]
(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于水中，加入氢氧化钠和硅藻土混匀，加热至88～92℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明，保留沉淀和滤液；
[0018]
(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后保留沉淀；
[0019]
(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得成品。
[0020]
优选的，所述步骤(1)中，以重量份计，磷酸二氢钠15～25份、硝酸钾35～45份、硫酸镁3～5份、氯化钙0.1～0.2份、硫酸亚铁0.2～0.3份、硫酸锰0.04～0.08份、菜籽油35～45份、蔗糖580～620份；水16900～17100份。
[0021]
优选的，所述步骤(4)中，所述土壤杆菌zx09种子液与所述步骤(1)的组分总体积的体积比为1:(95～105)。
[0022]
优选的，所述土壤杆菌zx09种子液为土壤杆菌zx09在培养基里生长后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水190～210份，蛋白胨1.5～2.5份，酵母粉0.8～1.2份，氯化钠1.5～2.5份。
[0023]
优选的，所述步骤(2)中，蒸汽灭菌是在温度为121℃灭菌25-35min。
[0024]
优选的，本发明所述调节皮肤微生态为改善皮肤微生物菌平衡；具体为改变皮肤在菌out种类的水平。
[0025]
优选的，本发明所述调节皮肤微生态为调节皮肤物种多样性。
[0026]
优选的，本发明所述调节皮肤微生态为维持皮肤微生态稳定性。
[0027]
优选的，本发明所述调节皮肤微生态为调控皮肤微环境的酸碱值。
[0028]
优选的，本发明所述调节皮肤微生态为促进皮肤常驻菌增殖，抑制皮肤暂驻有害菌和条件致病菌。具体地，所述调节皮肤微生态为促进表皮葡萄球菌增殖，抑制铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌。
[0029]
优选的，所述产品的活性成分包括β-1,3/α-1,3-葡聚糖，其成分还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0030]
优选的，所述产品中，β-1,3/α-1,3-葡聚糖的质量浓度小于0.5wt％。
[0031]
优选的，所述产品为抗炎症性皮肤病产品、美容产品或化妆品。
[0032]
优选的，所述炎症性皮肤病为由痤疮丙酸杆菌和/或铜绿假单胞菌异常导致的皮肤病，包括但不限于特应性皮炎、痤疮、湿疹、脂溢性皮炎和粉刺等。
[0033]
优选的，所述产品为外用制剂，局部施用。
[0034]
本发明的β-1,3/α-1,3-葡聚糖可适用于面部皮肤的日常保养和菌失衡的调节，也可用于颈部、躯干、手、臂、腿等其他身体部位以调节皮肤状况。
[0035]
本发明所述的产品可以是以通用方式制得的膏霜类、乳液类、液体、油类、精华、面膜、凝胶、摩丝、分散剂、喷雾剂等。
[0036]
本发明的有益效果是：
[0037]
本发明的β-1,3/α-1,3-葡聚糖能较大程度改变皮肤微生态结构，经检验证明，随着使用β-葡聚糖时间增加，特有out会增多，说明改变了皮肤在菌out种类的水平，改善了皮肤菌的平衡。
[0038]
本发明的β-1,3/α-1,3-葡聚糖能够使得皮肤物种丰富度增高，在一定程度上能够调节皮肤的物种多样性，进而调节皮肤微生态。
[0039]
本发明在皮肤不使用任何产品的洗脱期，铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌明显增加会影响皮肤微生态，经过了6周的β-1,3/α-1,3-葡聚糖产品试用后，对皮肤微生态起到了调节作用，能有效促进皮肤常驻菌增殖(尤其是表皮葡萄球菌)，而对皮肤暂驻有害菌(尤其是铜绿假单胞菌)和条件致病菌(尤其是痤疮丙酸杆菌)有抑制作用，从而使皮肤常驻菌处于优势地位，促进皮肤微生态平衡。
[0040]
本发明β-1,3/α-1,3-葡聚糖能够通过调节皮肤微生物菌平衡，调控皮肤微环境的酸碱值，进而改善皮肤生物屏障，维护皮肤健康。
[0041]
本发明从根本上调节皮肤的微生态平衡，克服了传统护肤品治标不治本或易产生副作用的缺陷，为皮肤微生态方面的研究开拓了新思路，奠定了基础。
附图说明
[0042]
图1花瓣图(t0组vs t3组vs t6组vs t9组)；
[0043]
图2种水平物种相对丰度柱形图；
[0044]
图3observed species指数组间差异蜜蜂图(t0组vs t3组vs t6组vs t9组)；
[0045]
图4chao1指数组间差异蜜蜂图(t0组vs t3组vs t6组vs t9组)；
[0046]
图5shannon指数组间差异蜜蜂图(t0组vs t3组vs t6组vs t9组)；
[0047]
图6simpson指数组间差异蜜蜂图(t0组vs t3组vs t6组vs t9组)；
[0048]
图7基于weighted unifrac距离二维pcoa分析；
[0049]
图8基于unweighted unifrac距离二维pcoa分析；
[0050]
图9种水平t-test组间物种差异分析图(t0 vs t3)；
[0051]
图10种水平t-test组间物种差异分析图(t3 vs t9)；
[0052]
图11种水平t-test组间物种差异分析图(t9 vs t6)；
[0053]
图12受试者脸部ph值变化分析图。
具体实施方式
[0054]
为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，除非另有限定，本发明所用所有技术和科学术语都具有为本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的含义。
[0055]
下述实施例中采用的方法如无特殊说明，均为本领域常规使用的方法。
[0056]
下述实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0057]
实施例1β-1,3/α-1,3-葡聚糖的制备
end)测序。对所有10名受试者的皮肤菌标本行16s-rdna v3+v4区测序，共获得了10170956条reads，单个标本最高含有95175条reads，最少含有54192条reads，通过对reads拼接，平均每样品测得84758
±
7342条tags，有效数据量达75695，质控有效率达89.18％。为研究各样本的物种组成，对所有样本的effective tags，以97％的一致性(identity)进行otus(operational taxonomic units)聚类，共得到13258个otus，然后对otus序列与silva138数据库进行物种注释。
[0077]
2、花瓣图
[0078]
通过花瓣图展现不同样本之间共有或特有otus，在otu水平上对不同样本之间的差异进行统计。
[0079]
统计结果见图1，t0、t3、t6和t9等四组标本在产品使用前后，较大程度改变了其皮肤微生态结构，均以特有otu占主导，随着使用β-葡聚糖时间增加，特有otu明显增多，说明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖改变了皮肤在菌out种类的水平。
[0080]
3、物种相对丰度
[0081]
根据物种注释结果，在种分类单元水平，物种相对丰度前十分别为痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、副凝聚小短杆菌、藤黃微球菌、泡囊短波单胞菌、南极异常球菌、武侯不动杆菌、鲁氏不动杆菌、巨紫荆，如表1和图2所示。
[0082]
表1种水平物种相对丰度前十名
[0083][0084]
实施例4β-1,3/α-1,3-葡聚糖对调节物种多样性的分析
[0085]
根据物种注释情况，进一步计算α多样性与β多样性，揭示不同处理或环境下的落结构差异特征。
[0086]
1.α多样性分析
[0087]
α多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性，主要用来反映物种丰富度和均匀度。本发明选取4个常用的α多样性指数进行分析，包括observed species指数，chao1指数，shannon指数，simpson指数。shannon指数和simpson指数越高表明样品物种多样性越高，observed species和chao1指数越高表明样品物种丰富度越高。
[0088]
(1)observed species指数
[0089]
见图3，observed species指数表示该样品中包含的物种数目，本次研究中以otu作为物种分类单元。通过wilcoxon秩和检验，发现测得的物种数在t0-t9两组间具有明显的
差异(p《0.05)，显著性p值为0.0309。测得的物种数在t3-t9、t6-t9、t0-t6等两组间不具有明显的差异(p》0.05),。
[0090]
(2)chao1指数
[0091]
见图4，chao1指数在t0-t9、t3-t9两组间具有差异(p《0.01)，测得的chao1指数在t0-t6、t6-t9、t0-t6等两组间不具有明显的差异(p》0.05)。
[0092]
(3)shannon指数
[0093]
见图5，shannon指数在t0-t6、t0-t3、t6-t9等两组间具有差异(p《0.0)，显著性p值为0.0000、0.0000、0.0002等，shannon指数在t3-t9两组间不具有明显的差异(p》0.05)。
[0094]
(4)simpson指数
[0095]
见图6，simpson指数在t0-t3、t0-t6、t0-t9、t3-t6等两组间具有差异(p《0.01)，simpson指数在t3-t9两组间不具有明显的差异(p》0.05)。
[0096]
综上，在3周的洗脱期内，observed species和chao1指数增高，但与t0相比没有统计学差异，随着连续6周使用β-葡聚糖，observed species和chao1指数进一步增高，与t0相比差异显著(p《0.01)，说明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖使得物种丰富度增高；而在3周的洗脱期内，shannon指数和simpson指数显著下降(p《0.01)，随着连续6周使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖shannon指数和simpson指数先明显下降后显著增高(p《0.01)，但尚未能恢复t0，说明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖能在一定程度上调节物种多样性。
[0097]
2.β多样性分析
[0098]
β多样性是对不同样本的微生物落构成进行比较分析。
[0099]
在本发明中，考虑使用同一产品带来的影响，故本发明基于weighted unifrac距离和unweighted unifrac距离来进行pcoa分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。如果样本距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起，落差异很大的样本则会远远分开。
[0100]
图7和图8所示t0组、t3组、t6组和t9组间在pcoa分析上存在统计学差异(p＜0.001)，从unweighted unifrac距离来进行pcoa分析，t0和t3组间落结构相似度更高，t6和t9组间落落结构相似度更高，且前两组与后两组落差异更大，进一步说明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖可调节皮肤微生态。
[0101]
实施例5β-1,3/α-1,3-葡聚糖对皮肤微生态稳定性的影响
[0102]
组间差异物种分析(t-test)
[0103]
通过统计组间差异物种分析，可以有针对性的出分组间丰度变化差异显著的物种，并得到差异物种在不同分组间的富集情况，同时，可以比较组内差异和组间差异的大小，判断不同分组间的落结构差异是否具有显著意义。为了寻各分类水平下，组间的差异物种，做组间的t-test检验。
[0104]
t-test分析表明，如图9所示，在3周的洗脱期内，铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌显著增加，表明在不使用任何产品的洗脱期，会影响皮肤微生态，其中铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌增加最为明显，经过了6周的用β-葡聚糖产品试用后(如图10所示)，铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌显著减少，表皮葡萄球菌显著增加，对皮肤微生态起到调节作用；其中，如图11所示，t6-t9期间，为使用产品后三周，组间差异物种无显著差异，表明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖后在一定程度上能够维持皮肤微生态稳定性。
[0105]
实施例6β-1,3/α-1,3-葡聚糖对皮肤微生态的lefse分析
[0106]
lefse分析即lda effect size分析，是一种用于发现和解释高维度生物标识(基因、通路和分类单元)的分析工具，通过这种分析方法可以实现多个分组之间以及各分组内部亚组间的比较，从而到各组之间在丰度上有显著差异的物种，并能够评价各个差异物种对整体差异的影响度。
[0107]
lefse分析表明在使用6周的β-葡聚糖产品期间，与t3洗脱期后相比，微生物属中表皮葡萄球菌增加，微生物属中铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌有统计学差异(p《0.0《0.05)，铜绿假单胞菌和痤疮丙酸杆菌先增后减，说明使用β-1,3/α-1,3-葡聚糖后能对皮肤微生态起到调节作用。
[0108]
实施例7β-1,3/α-1,3-葡聚糖对皮肤微生态的酸碱性分析
[0109]
见图12，在3周洗脱期内，受试者脸部ph值由中性向偏碱性改变，与t0相比差异显著，在皮肤高ph值环境下，微生物更为活跃，容易产生和释放过敏原，引发炎症；而与t3洗脱期后相比，经过了6周的用β-葡聚糖产品试用后，受试者脸部ph值由偏碱性向中性改善，从图12中可看到受试者脸部ph值明显转向皮肤的正常值(4.5-6.5)，说明β-1,3/α-1,3-葡聚糖能够通过调节皮肤微生物菌平衡，调控皮肤微环境的酸碱值，进而改善皮肤生物屏障。
[0110]
实施例8β-1,3/α-1,3-葡聚糖用于体外培养的皮肤微生物
[0111]
将β-1,3/α-1,3-葡聚糖作用于体外培养的皮肤微生物，验证其对皮肤微生物的调节作用：
[0112]
(1)将表皮葡萄球菌接种于营养肉汤培养基，铜绿假单胞菌接种于营养肉汤培养基，痤疮丙酸杆菌接种于gam培养液；(2)每种培养液各取10ml，各4份，分别加入0.1ml β-1,3/α-1,3-葡聚糖溶液，0.1ml青稞β-葡聚糖，0.1ml舞茸多糖溶液和0.1ml去离子水(空白对照)；(3)然后将表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌置于37℃下24h需氧培养，将痤疮丙酸杆菌置于37℃下48h厌氧培养；(4)用稀释平板法测定培养前后培养液中各种菌的数目，测定结果如表2所示：
[0113]
表2培养前后皮肤微生物计数比较(cfu/ml)
[0114][0115]
由表2中数据可知，本发明所述β-1,3/α-1,3-葡聚糖能有效促进皮肤常驻菌(如表皮葡萄球菌)增殖，而对皮肤暂驻有害菌(如铜绿假单胞菌)和条件致病菌(如痤疮丙酸杆菌)有抑制作用，从而使皮肤常驻菌处于优势地位，促进皮肤微生态平衡。
[0116]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用。2.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖的结构式为：3.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述β-1,3/α-1,3-葡聚糖按照以下制备方法获得：(1)将水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；(2)将步骤(1)所得的混合溶液的ph值调整至6.5～7.5，然后进行蒸汽灭菌；(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；(4)将土壤杆菌zx09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，调节通气流量至18～22l/min，搅拌转速250～270rpm，发酵温度设置为28～32℃，培养58～62h，发酵完成后得发酵液；(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于水中，加入氢氧化钠和硅藻土混匀，加热至88～92℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明，保留沉淀和滤液；(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后保留沉淀；(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得成品。4.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态为改善皮肤微生物菌平衡。5.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态为调节皮肤物种多样性。6.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态为维持皮肤微生态稳定性。7.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态为调控皮肤微环境的酸碱值。8.根据权利要求1所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态为促进皮肤常驻菌增殖，抑制皮肤暂驻有害菌和条件致病菌。9.根据权利要求1～8任意一项所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态产品为抗炎症性皮肤病产品、美容产品或化妆品。10.根据权利要求1～8任意一项所述的β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态产品是以通用方式制得的膏霜类、乳液类、液体、油类、精华、面膜、凝胶、摩丝、分散剂、喷雾剂等。

技术总结

本发明公开了一种β-1,3/α-1,3-葡聚糖在制备调节皮肤微生态产品中的应用。经研究，首次发现本发明的β-1,3/α-1,3-葡聚糖能够调节皮肤微生态，改善皮肤微生物菌平衡，调节皮肤物种多样性，并维持皮肤微生态的稳定性，维护皮肤健康。维护皮肤健康。维护皮肤健康。

技术研发人员：

晨光 王萌 杜玲玲

受保护的技术使用者：

四川合泰新光生物科技有限公司

技术研发日：

2022.08.25

技术公布日：

2022/11/29