一种脱髓鞘疾病的药物及应用

1.本发明涉及中医药研究开发利用领域，具体地说，是一种脱髓鞘疾病的药物及应用。

背景技术：

2.脱髓鞘疾病(demyelinating disease)是一种神经系统疾病，是髓鞘形成障碍或遭到破坏，所导致的疾病的统称。脱髓鞘疾病可以分为中枢神经系统脱髓鞘疾病(最多见，其中以多发性硬化、视神经脊髓炎谱系疾病为代表)、周围神经系统脱髓鞘疾病，以及中枢和周围神经系统联合脱髓鞘疾病。
3.多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是中枢神经系统的自身免疫性脱髓鞘疾病。在全球范围内，约有200多万人罹患该病，主要临床表现是运动障碍，视力、味觉、嗅觉、认知和精神障碍，共济失调等，具有高致残率和高复发率的特点，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。ms发病机制尚不清楚，且当前没有彻底治愈该疾病的特效药物，临床上多采用格列吡啶、富马酸二甲酯、β干扰素和激素等药物缓解疾病的进展和复发，但是存在药物耐受和毒、副作用大等缺点。
4.中医药在ms疾病方面具有资源丰富，疗效显著，毒、副作用小、价格低廉等独特优势，从中医药角度寻求有效ms疾病的药物和疗法获得愈来愈多的国内外学者的关注。酚(kaempferol，kae)是黄酮类化合物，广泛存在于多种蔬菜、水果以及中草药等植物中，最近研究发现酚作为一种常见且安全的膳食补充剂，具有抗炎、抗癌、抗抑郁、抗惊厥和保护脑缺血损伤等作用。
5.为了寻求新的中枢神经系统脱髓鞘疾病的药物，本发明以酚为研究对象，观察酚对ms疾病的效果，采用ms的经典动物模型
‑‑
eae小鼠进行实验研究，发现酚对eae脱髓鞘小鼠有很好的预防和效果，显著改善其神经功能障碍，减轻中枢炎性浸润，抑制脱髓鞘。
6.目前尚未见酚作为中枢神经系统脱髓鞘疾病的药物的相关研究和报道。

技术实现要素：

7.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脱髓鞘疾病的药物。
8.本发明的另一目的是，提供一种上述药物的用途。
9.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
10.一种脱髓鞘疾病的药物，所述的药物酚是一种天然黄酮类化合物，其结构式(ⅰ)所示。
[0011][0012]
优选地，所述药物为胶囊剂、片剂、粉剂、注射液或外用剂。
[0013]
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0014]
如上所述的药物在制备预防/脱髓鞘疾病药物中的应用。
[0015]
优选地，所述的脱髓鞘疾病为中枢神经系统脱髓鞘疾病，采用的脱髓鞘疾病动物模型是eae。
[0016]
优选地，所述的中枢神经系统脱髓鞘疾病为多发性硬化疾病。
[0017]
优选地，所述酚在制备改善eae小鼠的神经功能障碍、抑制中枢神经系统炎性浸润和髓鞘脱失药物中的用途。
[0018]
本发明优点在于：
[0019]
1、酚对eae小鼠有很好的预防和效果，可以显著缓解eae小鼠的神经功能障碍，减缓eae小鼠体重下降的趋势，降低疾病神经功能评分，并延迟了发病时间。酚在40mg/kg/d给药浓度时能明显减轻eae小鼠的脊髓炎性浸润，抑制eae小鼠中枢神经系统的髓鞘脱失。
[0020]
2、本发明为酚开辟了新的用途，为临床中枢神经系统脱髓鞘疾病提供新的候选药物。
附图说明
[0021]
附图1是成功构建eae小鼠模型；
[0022]
附图2是实验各组小鼠的神经功能评分；
[0023]
附图3是实验各组小鼠的体重变化；
[0024]
附图4是实验各组小鼠的脊髓he染；
[0025]
附图5是实验各组小鼠的脊髓lfb染。
具体实施方式
[0026]
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0027]
实施例1酚对eae脱髓鞘小鼠的作用
[0028]
1.实验材料
[0029]
1.1动物
[0030]
健康雌性c57bl/6小鼠24只，6周龄，体重18～20g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，spf级环境(恒温25
±
2℃，恒湿40％～50％)喂养。
[0031]
1.2试剂
[0032]
酚、生理盐水、百日咳毒素、完全弗氏佐剂、结核分枝杆菌h37ra、mog35-55、4％多聚甲醛。
[0033]
1.3仪器
[0034]
电动组织匀浆器(上海净信实业发展有限公司)、漩涡振荡仪(海门其林贝尔仪器公司)、电子天平(上海舜宇恒平仪器公司)。
[0035]
2.实验过程
[0036]
2.1eae模型乳化试剂的准备
[0037]
mog35-55溶于pbs缓冲液，配置终浓度为2mg/ml，在完全弗氏佐剂(cfa)中加入结核分枝杆菌h37ra至终浓度4mg/ml，将mog35-55溶液与cfa按1：1体积比进行乳化，采用电动组织匀浆器调至100w超声60分钟，冰上操作，超声1分钟，停止1分钟，防止温度过高影响试剂活性，待充分乳化后将乳化剂滴在水面，乳化剂聚集而不会分散，既为乳化成功。
[0038]
2.2百日咳毒素(ptx)的配置
[0039]
将0.2mg/mlptx用pbs缓冲液稀释至300ng/ml。
[0040]
2.3c57bl/6小鼠免疫方法
[0041]
在免疫当日(day0)异氟烷麻醉小鼠，于小鼠脊柱头颈部和后背分两点注射mog35-55乳化剂各100μl。即mog35-55200μg/只，腹腔注射ptx溶液200μl，即ptx 200ng/只，并观察小鼠麻醉后苏醒状态是否良好；在免疫后第2天(day2)再次腹腔注射ptx 200ng/只。
[0042]
2.4分组和给药方式
[0043]
实验前将6周龄的小鼠称重，随机抽取小鼠，分配到各组，设为正常组8只，eae组8只，酚给药组8只，适应性喂养1周。正常组不进行干预，正常喂养；eae组是自免疫当天开始用生理盐水灌胃0.2ml/只；酚组是在免疫前7日起开始给药，每只小鼠按照40mg/kg/d的标准灌胃，直至实验结束。
[0044]
3.一般情况观察
[0045]
3.1体重检测
[0046]
自免疫当日(day0)起，每日对实验各组小鼠进行称量，并记录小鼠体重的变化，直至免疫后30天(day30)。
[0047]
3.2疾病神经功能评分
[0048]
从免疫当日起对实验小鼠进行一般情况监测，记录神经功能评分，评分标准根据国际通用的5级评分进行评分：
[0049]
①
0分无异常表现；
[0050]
②
0.5分部分尾部瘫痪；
[0051]
③
1分尾部完全瘫痪；
[0052]
④
2分后肢轻度瘫痪或步态不稳；
[0053]
⑤
3分后肢完全瘫痪；
[0054]
⑥
3.5分双后肢完全瘫痪，前肢轻度瘫痪；
[0055]
⑦
4分四肢完全瘫痪；
[0056]
⑧
4.5分濒死状态；
[0057]
⑨
5分死亡。
[0058]
4.结果
[0059]
4.1eae小鼠发病典型症状
[0060]
通过前期预实验掌握了构建成熟稳定的eae小鼠模型方法。eae组小鼠发病起始于造模后第11天，发病高峰出现于造模后第17天，17天后病情逐渐进入缓解期，eae小鼠最高临床症状评分为4分，在整个实验过程中未出现小鼠死亡，eae小鼠的发病率为100％(图1)。
[0061]
4.2酚对eae小鼠的神经功能评和分体重的影响
[0062]
与eae组相比，酚组小鼠的发病起始及发病高峰时间均有所延迟，分别为第14
天和第20天，临床症状评分显著降低，酚对于缓解eae小鼠的临床症状具有一定预防和作用(图2)。在eae模型诱导后，各组小鼠的体重均有所下降，免疫后第4天起体重逐渐缓慢上升；eae组小鼠临近发病期体重开始出现显著下降，并且随病情加重而持续减轻，酚干预显著减缓了eae小鼠的体重下降趋势(图3)。
[0063]
实施例2：酚对eae脱髓鞘小鼠中枢神经系统的作用
[0064]
1.材料和方法
[0065]
1.1试剂
[0066]
生理盐水、多聚甲醛、异氟烷、苏木精、伊红、lfb染液、二甲苯、各种浓度梯度的乙醇、碳酸锂溶液、中性树胶。
[0067]
1.2仪器
[0068]
精密鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪器公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯)、石蜡包埋机、石蜡切片机(德国leica公司)、水浴锅(上海精宏实验设备公司)。
[0069]
1.3动物取材：
[0070]
在免疫后30天结束实验，异氟烷口鼻吸入进行麻醉，小鼠进行固定，打开小鼠胸腔，暴露出心脏，剪开心包膜，用穿刺针快速从左心室插入，动脉夹固定针尖，灌注少量生理盐水，待右心房逐渐膨胀时，剪开右心耳排液，继续灌注生理盐水30毫升，直至肝脏变白，换4％多聚甲醛灌注，直至小鼠尾巴变硬，四肢强直，表明固定成功。停止灌注，剪开小鼠的枕顶部皮肤，剥离颅骨，完整取出大脑，剥离小鼠的脊柱(腰膨大部位)，pbs清洗后，放入多聚甲醛中浸泡24h，准备包埋、切片，进行后续实验。
[0071]
1.4he染方法：
[0072]
①
将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2h；
[0073]
②
脱蜡：脱蜡二甲苯i、ii各10分钟，提前准备好盖玻片；
[0074]
③
覆水：100％(i、ii)、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟
×
3。
[0075]
④
苏木精染5分钟，根据染情况，可以适当增加或减少染时间，流水冲洗。
[0076]
⑤
5％乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜变浅成为蓝。
[0077]
⑥
伊红染1分钟，根据染情况，可以适当增加或减少染时间，流水冲洗。
[0078]
⑦
脱水：70％、80％、90％、100％乙醇各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。
[0079]
⑧
滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。
[0080]
1.5lfb髓鞘染方法：
[0081]
①
选好片子，放60℃烘箱2h，使石蜡融化。
[0082]
②
脱蜡至95％乙醇：二甲苯i 30分钟
→
二甲苯ii 30分钟
→
二甲苯iii 30分钟
→
无水乙醇i 2分钟
→
无水乙醇ii 2分钟
→
95％乙醇2分钟；
[0083]
③
lfb染：在0.1％lfb染液中过夜室温孵育16h；
[0084]
④
洗片：第二天取出片子
→
95％乙醇稍浸洗
→
纯水中稍浸洗；
[0085]
⑤
分化：0.05％的碳酸锂溶液进行分化，10s左右，放入70％乙醇稍浸洗，显微镜下观察脑灰质和白质能清晰辨别，灰质接近于透明，白质是蓝绿，停止分化，纯水稍浸洗；
[0086]
⑥
脱水、透明：80％乙醇2分钟
→
90％乙醇2分钟
→
无水乙醇i 2分钟
→
无水乙醇ii 2分钟
→
二甲苯i 2分钟
→
二甲苯ii 2分钟
[0087]
⑦
滴上中性树胶，封片。用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡，晾干后倒置显微镜进行拍照。
[0088]
2.结果
[0089]
2.1酚抑制eae脱髓鞘小鼠的炎性浸润
[0090]
he染显示，正常组小鼠的腰膨大部位细胞结构清晰，排列整齐，细胞间隙分明，无水肿、无炎性浸润、细胞坏死的等现象；eae小鼠腰膨大部位损伤明显，细胞排列紊乱，炎性细胞大量浸润，核质界限不明，染质固缩或聚集严重；与eae组相比，酚组小鼠的腰膨大损伤得到明显缓解，细胞排列整齐，细胞间隙分明，无炎性细胞浸润，染质固缩或聚集严重等现象(图4)。
[0091]
2.2酚抑制eae小鼠的髓鞘脱失
[0092]
lfb染显示髓鞘被染成蓝(因说明书中图片呈现灰，以此说明)，正常小鼠的髓鞘组织结构完整，分布均匀，无髓鞘脱失；eae小鼠脊髓可见大小不等的片状髓鞘脱失区域，白质中的空泡样脱髓鞘改变尤为明显；酚给药组小鼠的髓鞘比较完整，质地均匀，髓鞘脱失程度明显得到抑制(图5)。
[0093]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种脱髓鞘疾病的药物，其特征在于，所述的药物酚是一种天然黄酮类化合物，其结构式(ⅰ)所示。2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物为胶囊剂、片剂、粉剂、注射剂或外用剂。3.酚在制备预防/脱髓鞘疾病药物中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的脱髓鞘疾病为中枢神经系统脱髓鞘疾病，采用的脱髓鞘疾病动物模型是eae。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经系统脱髓鞘疾病为多发性硬化疾病。6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述酚在制备改善eae小鼠的神经功能障碍、抑制中枢神经系统炎性浸润和髓鞘脱失药物中的用途。

技术总结

本发明涉及一种脱髓鞘疾病的药物，由酚组成。本发明经实验证实，酚对EAE小鼠有很好的预防和效果，可以显著缓解EAE小鼠的神经功能障碍，减缓EAE小鼠体重下降的趋势，降低疾病神经功能评分，并延迟发病时间。酚在40mg/kg/d给药浓度时能明显减轻EAE小鼠的脊髓炎性浸润，抑制EAE小鼠中枢神经系统的髓鞘脱失。本发明为酚开辟了新的用途，为临床中枢神经系统脱髓鞘疾病提供新的候选药物。的候选药物。的候选药物。