中国糖尿病杂志2021 年5 月第29 卷第5 期Chin J Diabetes, M a y2021，Vol. 29，No. 5•371 •
•糖尿病基础研究•血管紧张素（1-7)对糖尿病大鼠胰岛素 分泌的影响及机制探讨
李晶晶王瑞娇程海华刘雅琳杨锦慧何军华
【摘要】目的探讨血管紧张素（l-7)[A n g-(l-7)]对S T Z诱导的D M大鼠In s分泌的影响及作
用机制。方法随机选取10只W istar大鼠为正常对照（N C)组，另取24只予高脂饮食喂养联合
吸音墙S T Z注射构建D M模型，造模成功的20只大鼠随机分为D M组、A ng~(l-7)组[Ang~(l-7) 300 fig/(kg-d)
皮下注射]，每组各10只。干预8周后检测F PG、FIns、血管紧张素II (A n g I I)水平，计算胰岛素抵抗
指数(H O M A-IR)；观察胰岛细胞病理变化；检测诱导型一氧化氮合酶(iN O S)、胰十二指肠同源框因子1 (P d x l)和GluT2 m R N A及蛋白表达。结果与N C组比较，D M组F P G、HOMA IR、Ang I I、
iNOS m R N A及蛋白表达升高（P< 0. 05 )，体重、Fins、Pdx 1m R N A和蛋白、GluT2 m R N A和蛋白表达
降低(尸<0.05)。与D M组比较，Ang~(l_7)组FIns、Pdxl m R N A和蛋白、GluT2 m R N A和蛋白表达升
高(尸<0.05),??0、只0\1八-11^、^\1屯11、丨1^051111^^\和蛋白表达降低(尸<0.05)。结论A ng-(l-7)
可能通过调节iN O S/P d x l/G ln T2通路促进In s分泌，改善胰岛功能及糖代谢。
【关键词】血管紧张素（1-7)；糖尿病；大鼠；胰岛素分泌；诱导型一氧化氮合酶/胰十二指肠同源
框因子l/G luT2
doi: 10. 3969/j. issn. 1006-6187. 2021. 05.010
Effect of angiotensin-(1-7) on insulin secretion in diabetic rats and its mechanism LI Jingjing, W ANG
Ruijiao, CHENG H aihua, et al. Department o f Endocrinology, The Second Hospital o f Shanxi Medical
University, Taiyuan 030001, China
Corresponding author: H E Junhua，E m ail••130****************
【Abstract】Objective To investigate the effect of angiotensin-(1~7) [Ang-(1~7)] on insulin secretion
in a rat model of streptozotocin (S T Z)-induced diabetes mellitus (D M) and its mechanism. Methods 10
Wistar rats were randomly selected as normal control group (N C) and fed with a standard diet. The other 24
rats were fed a high-fat diet combined with intraperitoneal injection of STZ to establish diabetic model. 20
successfully modeled rats were randomly divided into DM group and A n g-(1_7) group [ (A n g-(1-7) 300
\ig/(k g • d) ]. After 8 weeks intervention, levels of FPG, fasting insulin (Fins) and serum angiotensin II
(Ang II) and homeostasis model assessment of insulin resistance (H O M A-IR) were compared. The islet
morphology was observed with HE staining. The mRNA and protein expressions of inducible N O S(iN O S),
pancreatic duodenal homeobox-1 (P d x l) and glucose transporter - 2 (G luT2) were measured. Results
Compared with NC group, the levels of FPG, HOM A-IR, Ang II and the expression of iNOS mRNA and
protein increased (P<0. 05), while body-weight, F in s, Pdxl mRNA and protein, GluT2 mRNA and protein
expressions decreased in DM group (P<0. 05). Compared with DM group, F in s, Pdxl mRNA and protein,
GluT2 mRNA and protein expressions increased(P<0.05), and F P G, HOM A-IR, Ang II concentration and
the expression of iNOS mRNA and protein decreased in Ang - (1~7) group (F<0.05). Conclusion
基金项目：山西省自然科学基金（201901D111374)；山西省回国留学人员科研资助项目（2017-117)；山西省卫生健康委科研课题 (2019041)
作者单位:〇3〇0〇1太原，山西医科大学第二医院内分泌科
通信作者.•何军华,Email:130****************
金属工艺品制作•372•中国糖尿病杂志 2021年 5 月第 29 卷第 5 期 Chin J Diabetes，M a y2021，Vol. 29，No. 5
A n g-(l~7)m a y promote the secretion of insulin by regulating the iN O S/P d x l/G lu T2pathway, thereby
improving islet function and glucose metabolism.
【Key words】Angiotensin-( 1~7) ；Diabetes mellitus ； Rats ； Insulin secretion ； iN O S/Pdxl/G luT2
研究[13]表明，DM状态时交感神经兴奋，胰岛 局部RAS被异常激活，产生过多血管紧张素II (Ang II)，
其与血管紧张素II 1型受体(AT,R)结 合，引起胰岛炎症反应、氧化应激、组织纤维化和 胰岛P细胞凋亡，影响胰岛功能。血管紧张素 (l-7)[Ang-(l_7)]是RA S中的活性成分，主要由 ACE2水解Ang II生成，与Mas受体结合发挥拮 抗Ang II作用[4]。研究[5]发现，Ang-(l-7)可改善 DM诱导的白细胞募集，起抗炎作用。Ang_( 1-7) 可减轻高糖所致内皮细胞损伤[s]，通过改善葡萄糖 刺激的钙反应和线粒体膜电位，减少活性氧产生，对 受损胰岛卩细胞发挥保护作用[7]，表明Ang-(l-7) 与胰岛功能和糖代谢相关。
胰十二指肠同源框因子l(Pdxl)主要表达于 胰岛P细胞，参与调节Ins、GluT2等多个重要胰 岛P细胞特异性基因转录，对维持胰岛卩细胞数 目稳定和Ins分泌有重要意义[89]。葡萄糖主要通 过GluT2转运进人胰岛[3细胞，被葡萄糖激酶磷 酸化，诱导细胞表面A T P敏感的K+通道关闭，细胞膜去极化，细胞胞外Ca2+内流，触发胰岛卩细胞 In s颗粒的胞吐作用[1°]。DM状态下，胰腺局部 RAS过度活化，Ang II水平增加，主要通过氧化应 激途径，刺激胰腺NADPH氧化酶，产生大量活性 氧簇，干扰Pdx-1表达[1112]，导致GluT2转录及表 达受阻，致使葡萄糖诱导的Ins分泌受损。有研 究[13]表明，Ang-(1-7)能改善野生型小鼠Ins分泌。前期研究[14]发现，Ang-(l-7)可降低DM大鼠胰岛 局部诱导型一氧化氮合酶GNOS)表达，减少胰岛p 细胞凋亡，促进Ins分泌。目前,Ang-(l_7)通过调节 胰岛iNOS/Pdxl/GluT2通路改善Ins分泌尚不明 确。本研究通过探讨Ang-(l-7)对DM大鼠Ins分 泌的影响及可能机制，旨在为临床DM提供 依据。
材料与方法
一、实验材料
8周龄S P F级雄性Wistar大鼠34只，体重 (200±20)g，购自山西医科大学实验动物中心。STZ购自德国Sigma公司。Ang-(1_7)购自吉尔
生化上海有限公司。大鼠胰岛素ELISA试剂盒、
大鼠Ang II ELISA试剂盒、BCA蛋白质定量试
剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自武汉博士德生
物工程公司。TRIzol总RNA提取液购自宝生物
工程大连有限公司。TB Green Premix Ex Taq II、PrimeScript RT Master Mix 购自Takara生物科技
公司。兔抗鼠iNOS、Pdxl、GluT2抗体购自美国 Abeam公司，卩-actin、辣根过氧化物酶标记山羊抗
兔IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。
二、实验方法
1. 模型建立及分组:34只大鼠在12 h照明/12 h 黑暗循环光照条件下词养，自由饮水进食。随机
选取10只为正常对照（NC)组，普通词料喂伺。
剩余24只予高脂高热量词料(普通伺料中掺入蛋
黄粉、熟猪油、白糖，蛋白质16%，碳水化合物 38%，脂肪46%，总热量为20.54 KJ/g)喂养8周
后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L、pH4.5的柠檬酸盐缓冲液中）30mg/kg»
N C组腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲液。72 h后
尾静脉采血测FPG，非同日重复检测FPG或随机
血糖>16. 7 mmol/L为造模成功[15]，共20只大鼠
造模成功，随机分为DM组和Ang_(l-7)组，每组
各 10 只。Ang-(1-7)组皮下注射 Ang-(l-7) 300 (igAkg*d)，NC、DM组分别皮下注射等体积生理
盐水干预8周。本实验经山西医科大学动物伦理
委员会审核批准，符合国家关于实验动物管理
规定。
2. 生理生化指标检测：每周定期检测大鼠体重 及FPG。实验结束后采用20%乌拉坦(5 ml/kg)腹
腔注射麻醉后迅速打开腹腔，下腔静脉采血6 ml, 3000 r离心10 min，收集上清液，ELISA法检测Fins、Ang II水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA IR)
=FPGXFIns/22_5。
3.胰腺组织形态检测：处死大鼠后剥离完整 胰腺，放入4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、
浸蜡、包埋，制成石蜡切片（4 (im),H E 染后于光
中国糖尿病杂志202丨年5月第29卷第5期 Chin J Diabetes，M a y 2021，Vol. 29，No. 5
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学显微镜下观察胰岛组织病理变化。
4. 免疫组织化学检测：按照说明书进行操作， 将石蜡切片脱蜡水化；滴加3% H 202，室温孵育
10 min ；枸橼酸缓冲液高压修复暴露抗原；滴加羊 血清蛋白封闭，室温孵育30 min ;—抗（兔抗大鼠
Pdxl 、GluT 2单克隆抗体，1:50稀释），4°C 孵育过 夜；羊抗鼠H R P 二抗（1:50稀释）室温孵育30 min ；滴加链霉亲和素-生物素复合物（SABC )，室 温孵育20 min ;DAB 显；苏木素复染；脱水；中性 树脂封片；镜下观察：Pdxl 、GkiT 2蛋白被深染，根 据表达含量多少呈现橘黄至棕褐不等。随机
编号切片，400倍镜下拍摄图像，双盲选择8〜10 个视野，采用彩病理图像分析系统检测平均光
密度值。
5. 胰岛分离纯化：将预冷的0.8 g /L 胶原酶P
溶液2 m l 经胆总管逆行注入胰腺，待其膨胀后迅
速摘取完整胰腺放入3 m l 预冷的胶原酶P 中，于 37 °C 水浴中消化15 mm ，振荡使其呈细沙状，加人
4 °C 含10%胎牛血清的Hanks 液10 m l 终止消化， 采用600 pim 不锈钢网筛过滤，1500 r 离心2 min , 弃掉上清，重复清洗1遍后离心收集沉淀[16]。
6. 实时荧光定量PCR 检测：采用TRIzol 裂 解液提取胰岛总RNA ，逆转录合成cDNA ，实时荧
222a2光定量PCR 检测iNOS 、P d x l 及GluT 2的mRNA 表达。以p -actin 作为内参基因，采用f 法分析 各基因相对表达量。引物序列（5‘_3’）如下：丨?^03
引物上游 5’ - CACCTTGGAGTTCACCCAGT -
3 ’，下游 5 ’ -ACCACTCGTACTTGGGATGC -3 ’ ；
Pdxl 引物上游 S ’-GGTGCCAGAGTTCAGTGC -
TAA-S ’ ， 下游 5 ， -CTTCCCTGTTCCAGCGTTC
-3 ’ ； GluT 2 引物上游 5 ’ _AGCACATACGACAC -CAGACG -3’，下游 S ’-AAAGAACGAGGCGAC - CATT -S ’ ； p-actin 弓| *J ^5，_GCCACTGCCG -
CATCCTCT _ 3 ’，下游 5 ’ - CTGGAAGAGA - GCCTCGGGG -3,。弓丨物设计及合成由上海生工
生物工程技术服务有限公司完成。PCR 反应条件
为预变性(95°C 3 min )—变性（95°C 5 s )—退火/延 伸（60°C 20 s )，共40个循环。
7. Western blot 检测：称取分离、纯化胰岛，按 净重(g )：裂解液（ml ) = 1:10比例加入相应体积裂
解液进行匀浆，肉眼观察无明显组织块后冰上孵
育30 min 充分裂解，12000 r 离心10 min 后取上清 液测定BCA 蛋白浓度，按照每4 (i l 蛋白样品加人
1 (i l 蛋白上样缓冲液(5X loading buffer )比例，混合 蛋白样品和蛋白上样缓冲液，10C TC 加热5 mm ，以 充分变性。样品经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳后 转膜，5%脱脂奶粉封闭
2 h ，PVDF 膜与一抗于 4°C 摇床上孵育过夜，
二抗室温孵育2 h ，漂洗后滴 加ECL 发光显影，使用Image J 软件对条带进行 灰度分析。三、统计学处理
采用SPSS 22. 0软件进行统计学分析。正态 分布计量资料以I ± s 表示，组间比较采用
Ow -Waj ; ANOW i 法，两两比较采用LSD -/检验。 以F <0. 05为差异有统计学意义。结果一、各组一般资料及生化指标比较
与N C 组比较，D M 和Ang -(l -7)组FPG 、
HOMA -IR、Ang II 升高（P C 0.05)，体重、Fins 降
低（P <0.05)。与 DM 组比较，Ang -(l -7)组
FPG 、HOMA -IR、Ang II 降低（P <0.05),FIns 升
高（尸<0.05)。（表 1)
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NC
DM
Ang - (1-7)
iNOS Pdxl
GluT 2
与 N C 组比较仍 N C group ，T <0. 05；与 D M 组比较 w D M group ，叩<0• 05
图2各组胰岛组织iN O S 、P d x l 及G lu T 2m R N A 表达
Fig 2 Comparison of iN O S , Pdxl and G luT2 m R N A expression
表1各组一般资料及生化指标比较C r 土s n = 10)
Tab 1 Comparison of general data and biochemical indexes of each group(j :±5,w = 10)
组别
Group 体重(g )
Weight FPG (m m o l/L )Fins (m U /L )H O M A IR Ang II (n g /m l)N C 393.25士2. 54 4. 90 土 0. 5217.63±1.62 3.83±0.58 1.76 土 0.23D M 257.44 ±7. 5^18.30±1.25_8.13 土 1.94* 6. 61 土 1. 29. 2.49±0.42*A ng-(1-7)
260. 33±6.43*
12. 70土 1.45*3
9.91±0.44w
5.61土0.87%
2.17 土 0.31$
与 N C 组比较 w N C group, ^<0.05；与 D M 组比较仍 D M group, S P <0.05
二、各组H E 染结果
胰岛形态欠规则，但界限尚清，胰岛内细胞排列欠
H E 染显示，DM 组胰岛失去原有结构，形态 整齐，较DM 组有所改善，但未恢复至N C 组水极不规则，胰岛内细胞排列杂乱无序。Ang _( 1-7)组
平。（图1)
g- (1-7)数字电视伴侣
图1各组H E 染
Fig 1
H E staining in each group
三、各组 iNOS、Pdxl 及 GluT 2 mRNA 表达比较
与N C 组比较，DM 组iNOS mRNA 表达升高 (P <0.05) , Pdxl 、GluT 2 mRNA 表达降低
(P <0.05：K 与 DM 组比较，Ang -(l _7)组 iNOS
mRNA 表达降低 P <0. 05) , Pdxl 、GluT 2 mRNA 表达升高(P <〇.〇5)。（图2)
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与N C 组比较仍N C group ，•尸<0. 05；与D M 组比较w D M group,〒<0. 05
图4各组iN O S 、P d x l 、G lu T 2蛋白表达比较
Fig 4
66aaaaComparison of iN O S »Pdxl and GluT2 protein expression in each group
四、各组免疫组织化学Pdxl 、GluT 2蛋白表达比较
与N C 组比较，DM 组Pdxl 、GluT 2蛋白表达
降低（尸<0.05)。Ang -(l -7)组 Pdxl 、GluT 2 蛋白
表达高于DM 组(P <0. 05)。（图3、表2)
A ng- (1-7)
Pdxl
GluT2
图3各组胰岛P d x l 、G lu T 2蛋白免疫组织化学染
Fig 3 Comparison of Pdxl and GluT2 protein expression
表2各组P d x l 及G lu T 2免疫组织化学比较G ±5)
Tab 2 Comparison of immunohistochemistry results of Pdxl and GluT2 (jt ±5)
组别
Group Pdxl G luT2NC D M A n g -(l-7)
0.156 ±0.008 0.091 ±0.007 0.115 ±0.004•拉
0.146 ±0.007 0.089 ±0.005*0.122 士 0• 002*#
与N C 组比较仍N C group ，•尸<0. 05：与D M 组比较w D M group ，叩<0. 05
五、各组iNOS 、Pdxl 、GluT 2蛋白表达比较
与N C 组比较，D M 组iNOS 蛋白表达升高 (P <0.05)，Pdxl 、GluT 2 蛋白表达降低 C P <0. 05)。
与DM 组比较，Ang -(l -7)组iNOS 蛋白表达降低 (P <0.05) , Pdxl 、GluT 2 蛋白表达升高 (P <0.05)。（图 4)
5.
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