李慧杰;齐元富;李秀荣;张盈盈
【摘 要】目的:观察芪连扶正胶囊对肺癌干细胞免疫相关因子表达的影响,探讨相关机制.方法:体外常规培养肺癌A549细胞,免疫磁珠法分选干细胞,制备芪连扶正胶囊含药血清,按实验分组干预,Elisa检测各组IL-10、TGF-β1的表达情况,Western blot检测Foxp3表达情况,RT-PCR检测TGF-β1mRNA的表达情况.结果:对照组、芪连扶正胶囊组、顺铂组、芪连扶正胶囊+顺铂组的IL-10表达量、TGF-β1表达量、Foxp3表达量及TGF-β1mRNA表达量均依次降低,与对照组相比,各药组均有显著性差异( P<0.05或P<0.01) ,其中芪连扶正胶囊+顺铂组差异最明显,二者有协同作用.结论:芪连扶正胶囊可降低肺癌干细胞IL-10、TGF-β1、Foxp3表达,改善细胞免疫抑制状态,调节免疫重塑,进而抑制肺癌转移.%Objective: To observe the effect Qilian Fuzheng Capsule on the expressions of immune related factors in lung cancer stem cells( LCSCs) and explore the related mechanism. Methods: Lung cancer A549 cells were cultured in vitro, LCSCs were sorted out by immunomagnetic beads, finally serum containing of Qilian Fuzheng Capsule was prepared. LCSCs were intervened according to experimental grouping; afterwards, the expressions of IL-10 and TGF-β1 in each group were detected by Elisa method; the expression of Foxp3 was detected by Western blot method, and TGF-β1 mR-NA expression was detected by RT-PCR technique. Results: In terms of expressions of IL-10, TGF-β1, Foxp3, and TGF-β1mRNA, they were significantly decreaed in all medication groups(Qilian Fuzheng Capsule group, Cisplati-num group, Qilian Fuzheng Capsule +Cisplatinum group) compared to those in the control group ( P <0.05, P<0.01); of which, the differences of the group of Qilian Fuzheng Capsule plus Cisplatin were most obvious, it showed that the combination of Qilian Fuzheng Capsule and Cisplatin had synergistic effect. Conclusion: Qilian Fuzheng Capsule can reduce the expressions of IL-10, TGF-β1 and Foxp3 in LCSCs, it can improve the cellular immunosuppression and regulate immune remodeling to inhibit lung cancer metastasis.
【期刊名称】《中医药学报》
【年(卷),期】2018(046)004
【总页数】4页(P27-30)电厂水处理
【关键词】芪连扶正胶囊;肺癌干细胞;免疫重塑;肺癌转移
【作 者】李慧杰;齐元富;李秀荣;张盈盈
【作者单位】山东中医药大学附属医院,山东 济南250014;山东中医药大学附属医院,山东 济南250014;山东中医药大学附属医院,山东 济南250014;山东中医药大学附属医院,山东 济南250014
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的一小部分具有自我更新能力和分化潜能的细胞，亦是肿瘤发生、转移和复发的根源[1]。肿瘤转移过程中存在免疫逃逸现象，而免疫重塑是最终导致逃逸的关键[2]。中医药防治肿瘤在改善机体免疫功能、提高患者生活质量方面彰显优势，基于此，笔者观察了芪连扶正胶囊对肺癌干细胞(Lung cancer stem cell, LCSC)免疫相关因子白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3) 表达的影响，意在探讨其调节肺癌干细胞免疫重塑情况，以期为抑制肺癌转移及肺癌提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验细胞与动物
细胞为山东中医药大学附属医院中心实验室惠赠的人肺腺癌细胞系A549细胞株。实验动物为济南朋悦实验动物繁育有限公司SPF级体质量(200±10)g、雄性SD大鼠(质量合格证号SCXK(鲁)20140007)。
1.2 主要试剂药品
芪连扶正胶囊(山东中医药大学附属医院Z01080226);注射用顺铂(齐鲁制药有限公司H20023461);RPMI-1640培养基、胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限公司);CD133细胞分离试剂盒、PE标记的CD133抗体(美国Gene Copoeia公司);Elisa检测试剂盒(南京巴傲得生物科技有限公司);BCA蛋白质定量试剂盒、Foxp3一抗、β-actin一抗、标记二抗(北京百奥莱博科技有限公司)，反转录试剂盒(TaKaRa公司);引物(生工生物工程股份有限公司)。
1.3 仪器
德国BB5060UV型CO2培养箱;美国Thermo Forma超净工作台及全波长酶标仪;日本Olympus倒置相差显微镜;美国Becton Dickinson流式细胞仪;美国Bio-Rad Trans-Blot Turbo转膜仪;美国Bio-rad电泳系统;美国Alpha Innotech Fluor Chem Q成像分析系统;美国Therm Fisher PCR仪;ROCHE实时荧光定量PCR仪。
1.4 芪连扶正胶囊含药血清制备
购买体质量(200±10)g的雄性SD大鼠适应性喂养5天；随机分为芪连扶正胶囊组及对照组，芪连扶正胶囊组大鼠灌胃应用芪连扶正胶囊溶液，对照组应用等量生理盐水，每日灌胃1次、连续灌14 d；末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h10%水合氯醛麻醉大鼠；经腹主动脉取血，离心取血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，保存于-80℃冰箱备用。
1.5 免疫磁珠法分选肺癌干细胞
常规培养细胞，消化收集细胞，调整细胞浓度,清洗、加入缓冲液重悬细胞，按CD133细胞分离试剂盒说明逐步进行，流式细胞仪检测阳性细胞的百分率，分选的CD133+阳性比例
为80.79%，可用于后续实验。
1.6 Elisa法检测IL-10、TGF-β1
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常规培养细胞，按实验分组干预，继续培养48 h，离心收集，保存于-80℃冰箱备用；检测时，配制标准品，加样，封板温育30 min，洗板，加酶标试剂，重复后加显剂，震荡混匀，避光显15 min，加终止液，酶标仪450 nm波长下测定各孔吸光度值(OD值)，计算数据。
1.7 Western blot检测Foxp3
常规培养细胞，按实验分组干预，继续培养48 h，提取蛋白，BCA试剂盒蛋白定量。组装固定玻璃板，分别灌分离胶、浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶完全聚合后放入电泳槽内固定，加电泳缓冲液，拔出梳子，加样，电泳，转膜，丽春红染，5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃过夜，二抗恒温摇床1 h，ECL曝光成像，凝胶成像系统分析结果。
1.8 RT-PCR法检测TGF-β1mRNA
常规培养细胞，按实验分组加药，继续培养48 h，逐步提取总RNA，测定RNA浓度，标准内进行后续实验；其中引物序列为TGF-β1上游5＇-GTACCTGAACCCGTGTTGCT -3＇、下游5＇-GTATCGCAGGAATTGTTGC -3＇；GAPDH上游5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3＇、下游5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3＇；根据说明书逐步合成cDNA，PCR扩增，上机检测，根据公式2-△△CT处理实验数据。
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1.9 统计学方法
运用IBM SPSS19.0软件，数据处理采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Elisa检测肺癌干细胞IL-10、TGF-β1表达情况
电子台历
经单因素方差分析，与对照组相比，各药组均可降低细胞IL-10和TGF-β1的表达(P<0.05或P<0.01)；与DDP组相比，芪连扶正胶囊组及联合组的IL-10和TGF-β1表达情况均与之差异显著(P<0.05或P<0.01)。见表1。
2.2 Western blot检测肺癌干细胞Foxp3表达情况
对照组、芪连扶正胶囊组、顺铂组、联合组的肺癌干细胞Foxp3表达量分别为：(54.36±3.59)%，(41.20±4.03)%，(35.28±4.12)%，(26.51±3.96)%；经单因素方差分析，与对照组相比，各药组均可降低Foxp3表达(P<0.05或P<0.01)，两药联合效果最佳,见图1。
表1 Elisa检测肺癌干细胞IL-10、TGF-β1表达情况组别nIL-10(ng/L)TGF-β1(ng/L)对照组6119.03±6.99174.79±7.95芪连扶正胶囊组6108.91±8.07▲*160.51±8.03▲**顺铂组696.71±5.78▲▲141.28±6.97▲▲联合组656.41±7.95▲▲**97.34±7.63▲▲**
注：与对照组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01;与顺铂组比较，*P<0.05,**P<0.01
图1 Foxp3 Western blot图(注：图片从左到右依次为对照组、芪连扶正胶囊组、顺铂组、联合组)能量传送器
2.3 RT-PCR检测肺癌干细胞TGF-β1mRNA表达情况
对照组、芪连扶正胶囊组、顺铂组、联合组的肺癌干细胞TGF-β1mRNA表达量分别为：(1.27±0.26)%，(1.01±0.20)%，(0.77±0.14)%，(0.50±0.10)%；经单因素方差分析，与对
照组相比，各药组均可降低TGF-β1mRNA表达(P<0.05或P<0.01)，其中芪连扶正胶囊联合顺铂组差异最显著,见图2。
图2 TGF-β1mRNA PCR图
测绘工具3 讨论
早在1980年LCSC就被证实存在于肺癌组织中，它是来源于肺癌的一部分细胞，具有自我更新、增殖分化、强致瘤性、且可被特异性标记物标记[3]。基于肿瘤干细胞理论，多项研究结果证实了LCSC与肺癌发生、侵袭、复发转移密切相关，是肺癌转移的根源和潜在的靶点。LCSC因自我更新特性在肺癌发生时已占据优势，并不断增殖促进肺癌细胞生长，待生长到一定程度时，因增殖的肺癌细胞需要更多营养物质，LCSC便利用其多向分化能力转分化为内皮细胞样细胞，构建组织中的肿瘤血管形成，加速肿瘤生长；一旦肿瘤被发现并经手术、放化疗等后，肺癌细胞被大部分杀伤，但LCSC却可幸免，并在外干预停止后复燃肺癌细胞，导致肺癌复发转移[4-5]。
机体免疫系统具有抗肿瘤的保护功能，以及对肿瘤的重新塑型功能，我们将后者称之“免疫
重塑”，即免疫系统不断杀伤较高免疫原性的肿瘤细胞，同时忽略低免疫原性的肿瘤细胞，逐渐出现免疫原性更低、恶性程度更高的肿瘤表型，并在体内存留下来的过程[6]。免疫重塑不但可以影响机体免疫系统对肿瘤进行重塑与编辑，亦可改变机体免疫系统相关成分，从而更利于肿瘤免疫逃逸的形成，肿瘤发生浸润转移。免疫重塑的肿瘤细胞能产生大量抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，其通过直接接触及诱导该类因子削弱CTL细胞、NK细胞的杀伤活性，进而逃逸机体免疫监视，促进肿瘤转移[7-8]。其中，IL-10是参与肿瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有双向免疫调节特性，其介导免疫抑制机制是通过作用于不同免疫细胞亚多途径发挥免疫抑制，促进机体抗肿瘤免疫逃逸[9]。TGF-β可直接或间接作用于免疫细胞，诱导其功能缺失，帮助肿瘤逃避机体免疫监视功能，促进肿瘤发展；另外，TGF-β可促进肿瘤组织血管生成、加速肿瘤细胞和外基质之间相互作用，抑制机体免疫，利于肿瘤生长及加速其浸润转移[10-11]。而Foxp3是调节性T细胞最特异的生物学标记，在部分肿瘤中使肿瘤细胞具有了类Treg功能，该功能可抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，终致肿瘤免疫逃逸、肿瘤进展，且有研究发现肺癌中Foxp3表达与TGF-β1、IL-35等免疫抑制因子的表达呈正相关，提示FOXP3参与肺癌免疫逃逸，抑制机体抗肿瘤功能，促进肿瘤进展[12-13]。
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