敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０增殖、迁移及侵袭的机制探讨 倪 伟，姚 敏
Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆＰＩＰ５Ｋ１αｉｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌＢ１６Ｆ１０
ＮＩＷｅｉ，ＹＡＯＭｉｎ
ＢｅｎｇｂｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＡｎｈｕｉＢｅｎｇｂｕ２３３０００，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＰＩＰ５Ｋ１αｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｉｎｍｅｌａｎｏ
ｍａｃｅｌｌＢ１６Ｆ１０ａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＰＩＰ５Ｋ１αｗａｓｋｎｏｃｋｅｄｏｕｔｉｎＢ１６Ｆ１０ｔｈｒｏｕｇｈ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＴｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆＣＣＫ－８ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｗｏｕｎｄｈｅａｌ
ｉｎｇａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ
ＰＩＰ２ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥｌｉｓａ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣＣＫ－８ａｓｓａｙ
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ｐ－ＡＫＴ，ＣｙｃｌｉｎＡ２ａｎｄＣｙｃｌｉｎＤ１，ａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｉｎＢ１６Ｆ１０ｃｅｌｌｓｂｙｋｎｏｃｋｏｕｔ
ｏｆＰＩＰ５Ｋ１α．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｍｅｌａｎｏｍａ，ＰＩＰ５Ｋ１α，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０９）：１４８７－１４９１
【摘要】 目的：探讨敲除ＰＩＰ５Ｋ１α对黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０增殖、迁移和侵袭的作用及
机制。方法：采用
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术在Ｂ１６Ｆ１０细胞中敲除ＰＩＰ５Ｋ１α；采用ＣＣＫ－８法检测细胞的增殖活性；Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ检
测细胞迁移；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测细胞的侵袭能力；Ｅｌｉｓａ实验检测ＰＩＰ２的合成；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞蛋白表达变 化。结果：ＣＣＫ－８实验表明：敲除ＰＩＰ５Ｋ１α可明显抑制Ｂ１６Ｆ１０细胞的增殖。敲除ＰＩＰ５Ｋ１α明显抑制了
Ｂ１６Ｆ１０细胞的迁移和侵袭能力。在Ｂ１６Ｆ１０细胞中，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，总ＡＫＴ的蛋白表达不变，ｐ－ＡＫＴ、
ＣｙｃｌｉｎＡ２及ＣｙｃｌｉｎＤ１的蛋白表达下降。结论：ＰＩＰ５Ｋ１α可调节黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞中ｐ－ＡＫＴ、ＣｙｃｌｉｎＡ２
和ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白的表达，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。
【关键词】黑素瘤；ＰＩＰ５Ｋ１α；细胞增殖；迁移；侵袭
【中图分类号】Ｒ７３９．５ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０９．００４
【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０９－１４８７－０５
黑素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤，由痣或素斑发展而来，生长迅速，预后差，死亡率高［１］。黑素瘤好发于１８～６０岁的成年人中，由于其易于转移和复发，其平均生存期约为３０．３个月［２］。早期黑素瘤的常规方法是手术切除肿瘤和化疗［１］。然而，这些方法不能有效地控制黑素瘤的复发和远处转移，因此探索黑素瘤新的靶点势在必行。
ＰＩＰ５Ｋ１α是ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＰＴＥＮ通路的上游，参与调控
【收稿日期】 ２０１９－０８－０９
【作者单位】 蚌埠医学院，安徽 蚌埠 ２３３０００
【作者简介】 倪伟（１９８９－），男，江苏常州人，医师，硕士研究生，主要从事临床基础科研工作。Ｅ－ｍａｉｌ：２５００８１５９１＠ｑｑ．ｃｏｍ【通讯作者】 姚敏（１９６３－），女，湖南张家界人，主任医师，博士生导师，主要从事临床基础研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｙ０５８＠ｖｉｐ．
ｓｉｎａ．ｃｏｍＰＩＰ２的合成，同时参与ＡＫＴ的蛋白表达［３］。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ通路是一个控制细胞生存、代谢、运动和基因组不稳定性的核心通路［４］，因此ＰＩＰ５Ｋ１α可以通过调控ＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ通路，调节细胞的恶性行为。研究发现ＰＩＰ５Ｋ１α在乳腺癌的发生发展中发挥关键作用［３］，但是在黑素瘤中鲜有报道。
在本研究中，我们以黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０细胞作为研究对象，探究ＰＩＰ５Ｋ１α在黑素瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，并进一步检测ＰＩＰ５Ｋ１α对ＰＩＰ２合成的影响，同时检测其对磷酸化ＡＫＴ（ｐ－ＡＫＴ）以及周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达的调节作用，以期为黑素瘤的提供新的思路。
１ 材料与方法
１．１ 细胞与试剂
黑素瘤细胞株Ｂ１６Ｆ１０购买于中国科学院上海细胞库。ＤＭＥＭ高糖培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｙ公司）；胰酶、胎牛血
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现代肿瘤医学 ２０２１年０５月 第２９卷第０９期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０９
清（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；ＣＣＫ－８试剂盒（日本同仁公司）；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）；ＰＩＰ２Ｅｌｉｓａ试剂盒（美国ＥｃｈｅｌｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）；一抗ＰＩＰ５Ｋ１α、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ、ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１（美国Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司）。
１．２ 实验方法
硬质合金丝锥
１．２．１ 细胞培养 黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０的培养：黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０生长于含１０％胎牛血清及双抗（青霉素１００Ｕ／ｍＬ，链霉素０．１ｍｇ／ｍＬ）的ＤＭＥＭ高糖培养基中。细胞培养条件为：３７℃、５％ＣＯ
２
。当细胞融合达７０％～８０％的时候进行传代，按１∶３传代。
１．２．２ ＰＩＰ５Ｋ１α的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９质粒构建 我们利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术构建ｓｇ－ＰＩＰ５Ｋ１α敲除质粒，ＣＲＩＳＰＲ引物通过张锋教授实验室的网站ｈｔｔｐｓ：／／ｚｌａｂ．ｂｉｏ／ｇｕｉｄｅ－ｄｅ ｓｉｇｎ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ来设计，ｓｇ－ＰＩＰ５Ｋ１α的靶序列见下表１。
表１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ＰＩＰ５Ｋ１α序列
Ｔａｂ．１ ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ＰＩＰ５Ｋ１α
ＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３＇）
ｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α－ＦＣＡＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣ
ｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α－ＲＡＡＡＣＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＣＴＣＡＡＣ
ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α－ＦＣＡＣＣＧＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴ
ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α－ＲＡＡＡＣＡＧＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＧＣＣＧＧＡＴＡＣ
１．２．３ ＰＩＰ５Ｋ１α敲除的黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０的稳转细胞株构建 ２９３Ｔ细胞消化铺板。第二天，结合使用包装质粒ｐＶＳＶｇ和ｐｓＰＡＸ２各１．５μｇ，将ｓｇ－Ｖｅｃｔｏｒ以及ｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α、ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α各２μｇ转染至２９３Ｔ细胞。４８ｈ后收集病毒上清液，离心３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，２０ｍｉｎ，储存在４℃冰箱备用。
转染前２４ｈ，选取生长状态良好的Ｂ１６Ｆ１０细胞，以每孔５×１０５个加入６孔板中培养，加入４ｍＬ新鲜培养基，待细胞浓度达到５０％开始转染。培养基更换为病毒液及转染增强剂ｐｌｏｙｂｒｅｎｅ，３７℃培养箱孵育１８ｈ后，弃去转染液，更换为新鲜的ＤＭＥＭ完全培养基；转染４８ｈ后加入嘌呤霉素对细胞进行筛选以获得ＰＩＰ５Ｋ１α稳定敲除的Ｂ１６Ｆ１０稳转株。１．２．４ ＣＣＫ－８法检测黑素瘤细胞的增殖能力 取生长状态良好的黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０，常规消化计数后接种至９６孔板（２０００个细胞／孔）。分别培养２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ后，弃旧培养基，更换为１００μＬ新的含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全培养基，同时每孔加入１０μＬＣＣＫ－８试剂，放入细胞培养箱中孵育２ｈ，随后在４５０ｎｍ处测定各孔的光密度（ＯＤ）值。实验重复３次。
１．２．５ Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ检测细胞的迁移能力 取对数生长期状态良好的黑素瘤细
仿真恐龙制作胞Ｂ１６Ｆ１０（ｓｇ－ＶＥ、ｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α和ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α）。在１２孔板背面画横线标记以方便记录拍照，消化细胞铺板，以铺满为准，待细胞贴壁后用１ｍＬ头垂直于孔板做细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致，用ＰＢＳ清洗后加入无血清培养基，培养２４ｈ之后拍照记录。实验重复３次。
外室1H
１．２．６ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测细胞的侵袭能力 基质胶４℃融化呈液态，按１∶６的比例与无血清的ＤＭＥＭ培养基混匀（冰浴操作）；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室中加入１００μＬ上述基质胶稀释液，３７℃细胞培养箱中孵育１２ｈ凝固；取生长状态良好的黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０（ｓｇ－ＶＥ、ｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α和ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α），常规消化计数，取５×１０４个细胞，用２００μＬ无血清的ＤＭＥＭ培养基重悬至Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的上室，下室中加入５００μＬ含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全培养基，置于３７℃细胞培养箱孵育２４ｈ；ＰＢＳ清洗三次后用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗三次后０．１％结晶紫染１５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗后用棉签擦去上室内细胞，于显微镜下拍照记录。
１．２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白表达 裂解细胞并提取各组细胞总蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，随后将蛋白转膜至ＰＶＤＦ膜上，５％牛奶室温封闭１ｈ，ＴＢＳＴ洗３次后，分别加入ＰＩＰ５Ｋ１α、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ、ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１的一抗（１∶１０００）进行免疫印迹，冰箱孵育过夜；次日，ＴＢＳＴ洗４次后，再用１∶５０００浓度的相对应
二抗进行杂交，室温孵育１ｈ，弃二抗，用ＴＢＳＴ洗４次后，曝光。
１．２．８ ＰＩＰ２Ｅｌｉｓａ检测 收取各组等量的细胞，ＴＣＡ裂解细胞，分离干燥提取ＰＩＰ２脂质，将提取好的ＰＩＰ２与标准品分别加至培养板内，混匀ＰＩＰ２检测剂加至各孔内孵育１ｈ，每孔吸取等量液体转移至检测板，检测板室温孵育１ｈ之后ＰＢＳ－Ｔ洗涤三次，加入二抗检测液室温孵育１ｈ之后ＰＢＳ－Ｔ洗涤三次，分别加入显液与终止液之后于酶标仪４５０ｎｍ下检测ＯＤ值。
１．３ 统计学方法
运用统计学软件ＳＰＳＳ２３．０进行统计分析。比较两组之间差异采用独立样本双侧ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 成功建立稳定敲除ＰＩＰ５Ｋ１α的Ｂ１６Ｆ１０细胞株我们构建了ＰＩＰ５Ｋ１α稳定敲除的ｓｇ－ＰＩＰ５Ｋ１α质粒，将其转染至黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０中，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＰＩＰ５Ｋ１α的敲除效率。结果显示：与对照组相比，ＰＩＰ５Ｋ１α稳定敲除组的Ｂ１６Ｆ１０的ＰＩＰ５Ｋ１α表达量明显降低，说明稳定敲除ＰＩＰ５Ｋ１α的黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０细胞株构建成功，见图１
。
图１ Ｂ１６Ｆ１０细胞ＰＩＰ５Ｋ１α敲除细胞系的建立Ｆｉｇ．１ ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＢ１６Ｆ１０ＰＩＰ５Ｋ１αｋｎｏｃｋｏｕｔｓｕｂｌｉｎｅｓ
２．２ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞增殖能力在黑素瘤细胞株Ｂ１６Ｆ１０成功将ＰＩＰ５Ｋ１α敲除后，我们采用ＣＣＫ－８法检测ＰＩＰ５Ｋ１α对Ｂ１６Ｆ１０细胞增殖能力的影响。结果显示：与对照组相比，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，Ｂ１６Ｆ１０细胞的增殖能力明显减弱，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０００１，Ｐ＜０．０００１），见图２。该结果说明敲除ＰＩＰ５Ｋ１α显著抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞的增殖能力。
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·倪 伟，等 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０增殖、迁移及侵袭的机制探讨
图２ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制了黑素瘤细胞的增殖
Ｆｉｇ．２ ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＰＩＰ５Ｋ１αｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ
Ｖｓｓｇ１－ＰＩＰ５Ｋ１α，ｓｇ２－ＰＩＰ５Ｋ１α， Ｐ＜０．０００１．２．３ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞迁移能力在黑素瘤细胞株Ｂ１６Ｆ１０中成功将ＰＩＰ５Ｋ１α敲除后，我们采取Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ的方法检测Ｂ１６Ｆ１０细胞各组细胞的迁移能力变化。结果显示：与对照组相比，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，Ｂ１６Ｆ１０细胞的迁移能力显著降低，见图３。说明敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞的迁移能力。
２．４ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞侵袭能力接下来，我们进一步检测敲除ＰＩＰ５Ｋ１α对黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０侵袭的作用，结果发现：与对照组相比，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，Ｂ１６Ｆ１０细胞的侵袭能力也明显降低，见图４。说明敲除ＰＩＰ５Ｋ１α确实能显著抑制黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞的侵袭能
力。
图３ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制了黑素瘤细胞的迁移能力
Ｆｉｇ．３ ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＰＩＰ５Ｋ１αｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌ
ｓ
图４ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制了黑素瘤细胞的侵袭能力（结晶紫染×２００）
Ｆｉｇ．４ ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＰＩＰ５Ｋ１αｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔｓｔａｉｎｉｎｇ×２００）
２．５ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α抑制ＰＩＰ２的合成
我们通过使用Ｅｌｉｓａ试剂盒检测敲除ＰＩＰ５Ｋ１α对ＰＩＰ２合成的影响。结果显示：与对照组相比，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，ＰＩＰ２的合成受到了明显的抑制，差异有统计学意义（Ｐ＝０．０００２，Ｐ＝０．０００３），见图５。
２．６ 敲除ＰＩＰ５Ｋ１α对黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞增殖和转移相关蛋白表达的影响
我们采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测敲除ＰＩＰ５Ｋ１α对黑素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞增殖和转移相关蛋白表达的影响。结果显示：与对照组相比，敲除ＰＩＰ５Ｋ１α后，黑素瘤细胞Ｂ１６Ｆ１０的总ＡＫＴ蛋白表达不变，而ｐ－ＡＫＴ、ＣｙｃｌｉｎＡ２及ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达显著降低，见图６。
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逆变效率９玻璃包装箱
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现代肿瘤医学 ２０２１年０５月 第２９卷第０９期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０９
图５ Ｅｌｉｓａ检测ＰＩＰ２的合成
Ｆｉｇ．５ ＴｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＩＰ２ｄｅｌｅｃｔｅｄｂｙＥｌｉｓａ
［１２］ ＩＨＬＥＮＴ，ＡＢＲＡＨＡＭＲＴ．Ｔｈｅｐｔｅｎ－ｐａｒｋｉｎａｘｉｓ：Ａｔｔｈｅｎｅｘｕｓｏｆ
ｃａｎｃｅｒａｎｄｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌ，２０１７，６５（６）：９５９－９６０．
［１３］ ＸＵＪ，ＧＯＮＧＬ，ＱＩＡＮＺ，ｅｔａｌ．ＥＲＢＢ４ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｖｉａｔｈｅＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌＲｅｐ，２０１８，３９（６）：２８９２－２８９８．
［１４］ ＫＵＭＡＲＳ，ＡＧＮＩＨＯＴＲＩＮ．Ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ，ａｐｉｐｅｒａｌｋａｌｏｉｄｔａｒ
ｇｅｔｓＲａｓ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇａｘｉｓｔｏｉｎｈｉｂｉｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎＤＭＨ／ＤＳＳｉｎｄｕｃｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２０１９，１０９：１４６２－１４７７．
［１５］ ＺＨＡＯＹ，ＰＡＮＧＷ，ＹＡＮＧＮ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－５１１ｉｎｈｉｂｉｔｓｍａ
ｌｉｇｎａｎｔｂｅｈａｖｉｏｒｓｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＳＯＸ９ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，２０１８，５３（６）：２７１５－２７２６．
［１６］ ＰＥＮＧＸ，ＷＡＮＧＺ，ＬＩＵＹ，ｅｔａｌ．ＯｘｙｆａｄｉｃｈａｌｃｏｎｅＣｉｎｈｉｂｉｔｓｍｅｌ
ａｎｏｍａＡ３７５ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｖｉａｓｕ
ｐｐｒｅｓｓｉｎｇＰＩ３Ｋ／ＡｋｔａｎｄＭＡＰＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，２０１８，２０６：３５－４４．
［１７］ ＬＩＡＯＺ，ＺＨＡＯＪ，ＹＡＮＧＹ．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＨ１９ｉｎ
ｈｉｂｉｔｓｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＮＦｋａｐｐａＢａｎｄＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＭｏｌＭｅｄＲｅｐ，２０１８，１７（５）：７３１３－７３１８．
［１８］ ＤＡＮＧＮ，ＭＥＮＧＸ，ＭＡＳ，ｅｔａｌ．ＭＤＡ－１９ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｐｒｏｇｒｅｓ
ｓｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｍａｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＯｐｅｎＭｅｄ
（Ｗａｒｓ），２０１８，１３：４１６－４２４．［１９］ ＢＯＢＵＳＴＵＣＧＣ，ＫＡＳＳＡＭＡＢ，ＲＯＶＩＮＲＡ，ｅｔａｌ．ＭＧＭＴｉｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎｉｎＥＲｐｏｓｉｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｌｅａｄｓｔｏＣＤＣ２，ＴＯＰ２
Ａ，ＡＵＲＫＢ，ＣＤＣ２０，ＫＩＦ２０Ａ，ＣｙｃｌｉｎＡ２，ＣｙｃｌｉｎＢ２，ＣｙｃｌｉｎＤ１，ＥＲａｌｐｈａａｎｄＳｕｒｖｉｖｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，９（５１）：２９７２７－２９７４２．
（编校：张西敏）
ＣＣＤＣ２５在非小细胞肺癌细胞中高表达及其促细胞增殖的分子机制
郭映雪１，２，侯再昱１，２，蔡思琦１，２，于 洋１，２，张秀鹏１，２，苗 原１
，２ＴｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＣＤＣ２５ｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ＧＵＯＹｉｎｇｘｕｅ１，２，ＨＯＵＺａｉｙｕ１，２，ＣＡＩＳｉｑｉ１，２，ＹＵＹａｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＸｉｕｐｅｎｇ１，２，ＭＩＡＯＹｕａｎ
１，２１
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＳｈｅｎｙａｎｇ１１０００１，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，
飞轮齿圈
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＳｈｅｎｙａｎｇ１１０００１，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏａｓｓｅｓｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆＣＣＤＣ２５ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｃｅｌｌｓａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｈｏｗＣＣＤＣ２５ｍｏｄｕｌａｔｅＮＳＣＬＣｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＧＥＰＩＡｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＣＤＣ２５ｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗｈｏｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｔｉｏｎｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＹＡＰ，ｐ－ＹＡＰ，ＬＡＴＳ１ａｎｄｐ－ＬＡＴＳ１ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＣｌｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＭＴＳａｓｓａｙｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅ
ｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎＣＣＤＣ２５ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣＣＤＣ２５ｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｈｏｓｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｍｏｔｅｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＣＤＣ２５ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＹＡＰｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｈｕｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＹＡＰ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＣＣＤＣ２５ｍａｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎＹＡＰｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＮＳＣＬＣ，ＣＣＤＣ２５，ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１
，２９（０９）：１４９１－１４９５【摘要】 目的：探讨ＣＣＤＣ２５蛋白在非小细胞肺癌细胞中的表达及其对非小细胞肺癌增殖的影响。方法：应用ＧＥＰＩＡ数据库分析ＣＣＤＣ２５在肺癌组织中表达明显高于癌旁组织，结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测和免疫荧光，检测其在非小细胞肺癌细胞系中的表达和定位。Ｗｅ
ｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＹＡＰ、ｐ－ＹＡＰ、ＬＡＴＳ１、ｐ－ＬＡＴＳ１蛋白表达量。克隆形成
实验和ＭＴＳ实验检测ＣＣＤＣ２５过表达对肿瘤细胞增殖能力的影响。结果：ＣＣＤＣ２５在非小细胞
【收稿日期】 ２０２０－１１－１７ 【修回日期】 ２０２０－１２－０４【基金项目】 国家自然科学基金（编号：８１４７２８０５）
【作者单位】 １中国医科大学附属第一医院病理科，辽宁 沈阳 １１０００１
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中国医科大学基础医学院病理学教研室，辽宁 沈阳 １１０００１
【作者简介】 郭映雪（１９９５－），女，辽宁大连人，硕士，主要从事肺癌的研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：２０２２４２２２１７＠ｑｑ．ｃｏｍ
【通讯作者】 苗原（１９７９－），男，辽宁沈阳人，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事癌症相关的诊断及肺癌的研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｍｕｍｉ
ａｏｙｕａｎ＠１６３．ｃｏｍ
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１９４１·现代肿瘤医学 ２０２１年０５月 第２９卷第０９期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０９
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