一、实验目的
1.了解凝胶层析的原理及其应用。
2.通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。
3.了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。
二、实验原理
（一）蛋白质分子量的测定
蛋白质是生命过程中最重要的物质之一, 近年来已成为生命科学领域的研 究热点[1]。分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等[2-4]。
（二）凝胶层析法
层析法，又称层分析法或谱法（Chromatography），在1903-1906年由俄国植物学家M.Tswett首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟，灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是
凝胶层析等方法[5]。
凝胶层析法（gel filtration），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透谱法(GPC )、排阻谱法、凝胶过滤谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等[6]，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在
信号发射器适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，
再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
由于其分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等
特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有谱技术中
最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。虽然其分离效果不及高效液相谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化
达到更好的效果[7]。
（三）凝胶
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔封胶机
网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（dextran，商品名为SePhadex），凝胶型号不同，
孔隙度不同，但都不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小
有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应
的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，
适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。
（四）测量方法
t型铝型材凝胶过滤层析, 是一种分离不同大小分子的分配层析, 被分离物质
的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配, 混合物随流动相流经
层析柱时, 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动,
混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离, 这种方法操作简
便, 费用较低, 重复性好带通滤波器
[8]。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称为“分子筛”。其
具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。经过不
少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量
的方法[9]。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。Vt由三部分组成，即Vt=Vo+Vi+Vg。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之 间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，
相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后
的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。
而洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系为：
声音检测电路
Ve=Vo+Kd·Vi
Ve是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，
大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰[10]。Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内
部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大
小分布有关，而与柱的长短粗细无关。Kd可通过实验求得：
Kd=（Ve- Vo）/Vi
上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子多媒体网络中控
物质的溶液（带颜为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分
子量约200万的蓝葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g
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