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·基础研究·
谢晓明1刘宏亮1,3高宇1,3姚忠祥2詹晓黎2吴永涛
摘要
目的：研究小鼠帕金森病(PD)模型急性期中脑转录因子EN1表达变化的特点及小鼠的自发性活动改变。
方法：应用6-羟多巴胺（6-OHDA）纹状体注射制备小鼠PD模型；旷场试验观察其行为学变化；免疫组织化学/荧光
染检测注药后24h内中脑EN1、酪氨酸羟化酶（TH）的表达变化。
结果：与对照组相比，模型组运动方式明显异常，7d内基本恢复正常；运动总量随注药时间延长呈恢复趋势，但与对
照组对比无显著差异；中央区域活动时间逐渐减少，反映了焦虑指数增高。与对照侧相比，实验侧中脑EN1免疫阳
性细胞数在3—9h时已出现减少，12—18h时已较显著，18h为65.2±22.3%（P<0.05），21h时减少非常显著。TH阳性
的多巴胺能（DA）神经元数目也随时间逐渐减少，但时间上略晚于EN1，15h才可见减少，18h时减少明显，为68.3±
1.2%（P<0.05）。EN1在中脑主要定位于细胞核，但也可见于细胞浆。
结论：注射6-OHDA后，小鼠出现行为学改变，焦虑指数增高；实验侧中脑EN1和TH阳性细胞数均随时间逐渐减
少，且EN1变化早于TH，提示转录因子EN1的减少可能是诱导DA神经元凋亡及PD部分症状出现的重要原因。
关键词帕金森病；转录因子EN1；酪氨酸羟化酶；多巴胺能神经元；旷场试验
中图分类号：R742.5文献标识码：A文章编号：1001-1242（2012）---
Expression changes of transcription factor EN1in the midbrain of mice model of Parkinson's disense/XIE
Xiaoming,LIU Hongliang,GAO Yu,et al.//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,2012,27():
Abstract
Objective:To characterize the expression changes of transcription factor Engraileel1(EN1)in the midbrain and
第一语音locomotor activity of Parkinson's disense(PD)mice model in acute stage after6-hydroxydopamine(6-OHDA)injec-
tion.
Method:PD mice models were induced by intra-striatal6-OHDA injections.The open-field test was used to as-
sess their behavior.The expressions of EN1and tyrosine hydroxylase(TH)in the midbrain were examined in24
hours after operations by immunohistochemistry and immunofluorescence.
Result:Compared to control mice,the behavior of model mice was noticeable affected,which recovered in7days;
their total distance travelled recovered after the injection,but didn't contrast sharply with control group;the time
spent in the centre-area exhibited a gradual diminution which indicate an increased anxious state.Compared with
control sides,the expression of EN1in the experimental sides decreased3—9hours after injections and became
apparent after12—18hours and significant after21hours,with65.2±22.3%（P<0.05）at18h.similar to EN1,the
TH-positive dopaminergic neurons reduced over time.But its reductions were later than EN1,with apparent and no-
ticeable changes15or18hours after the operation separately,68.3±1.2%（P<0.05）at18h.In the midbrain，EN1
was located mainly in the nucleus and less in cytoplasm.
DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2011.期数.文章编号（如：001）
冶金石灰
*基金项目：国家自然科学基金（30672732），第三军医大学青年创新人才基金(2009XQN26)
1第三军医大学西南医院康复医学科，重庆,400038；2第三军医大学基础部组织学与胚胎学教研室；3通讯作者
作者简介：谢晓明，女，在读硕士；收稿日期：2011-09-30
Chinese Journal of Rehabilitation Medicine
帕金森病（Parkinson'Disease,PD）是中老年临床康复常见问题，以静止性震颤、运动迟缓、姿势步态异常等为特点。PD发病机制迄今未明，以黑质多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元大量变性丢失为病理特征[1]。近年来关于Engrailed(EN)的研究越来越受到重视。EN是一类同源结构域转录因子，与DA 神经元关系密切，其正常表达对于中脑DA神经元的发育、存活及功能状态的维持十分重要。EN有两种同系物，Engrailed1（EN1）和Engrailed2（EN2），在成年期中脑主要表达为EN1蛋白[2—3]。
在PD病变中EN1是否参与DA神经元的损伤过程，目前尚未见详细报道。我们从影响DA神经元发育与存活的转录因子EN1着手，系统研究EN1在PD病变导致特征性DA神经元损伤中的可能作用机制。本文通过免疫组化、荧光染及旷场行为学法，观察急性期特定时间点PD模型小鼠中脑EN1蛋白与DA神经元特异性蛋白酪氨酸羟化酶（tyro-sine hydroxylase，TH）的表达变化特点，了解二者发生改变的时间及先后特点，以及其运动行为的恢复情况，以期为进一步研究EN1与DA神经元损伤之间的关系、PD病理生理学机制及PD临床康复提供线索。
1材料与方法
1.1实验动物及PD模型制作
约9周龄C57BL/6成年小鼠（第三军医大学实验动物中心），雌雄不限。模型组小鼠麻醉后固定于脑立
体定位仪（KDScientific）上，暴露颅骨。参照图谱[4]，定位纹状体坐标点（前囟+0.04cm；旁开±0.18cm；硬膜下-0.35cm）。6-羟多巴胺(6-hydroxy-dopamine,6-OHDA)（Sigma）用含0.2%维生素C的生理盐水溶解，2μg/μl。实验侧(右侧纹状体)注射2μl6-OHDA，对照侧(左侧纹状体)注射等量含0.2%维生素C的生理盐水作为对照[5]。正常对照组不做任何处理。
1.2旷场实验
每天同一时间、术后连续7d行模型组（n=10）与对照组（n=10）旷场试验5min，Anymaze动物行为学视频分析系统（上海软隆）分析小鼠5min内运动总路程和中央区域活动时间[6]。
1.3取材
术后3h/6h/9h/12h/15h/18h/21h/24h时（n=24,3只/时间点）灌注取材。生理盐水冲净血液后Zam-boni's固定液灌注固定，取脑放于固定液中固定保存48h。4℃30％蔗糖固定液脱水过夜，OCT包埋，恒冷冰冻切片机（德国Leica）冠状切片(20μm)。
1.4免疫组织化学/荧光染
中脑切片以0.0lmol/L PBS缓冲液漂洗。3％H2O2室温封闭15min，1％BSA/0.4%TritonX100封闭液37℃封闭30min，一抗EN1或TH抗体（山羊抗小鼠EN1或TH抗体，Santa Cruz）(1：100)37℃孵2h
弱碱水设备后4℃过夜。二抗(HRP标记兔抗山羊IgG，中杉公司)37℃孵2h，ABC复合物（Vector）37℃1h，DAB显。必要时苏木素复染15s。荧光染于一抗后用荧光标记二抗（TRITC标记驴抗山羊IgG，Santa Cruz）37℃孵2h，DAPI复染30s。阴性对照组分别以PBS和山羊正常血清代替一抗，余同。OLYMPUS显微镜观察并记录。
1.5统计学分析
IPP5软件分析图像计算阳性细胞数目。实验侧与对照侧表达对比及旷场试验模型组与正常组的比较均采用配对样本t检验，SPSS18.0统计软件分析，以P<0.05为具有显著性差异。
2结果
2.1模型小鼠的行为学改变
与对照组相比，模型组小鼠5min自发性活动模式如运动轨迹、运动区域等均表现异常。多于术毕
Conclusion:Activity of model group altered and their anxiety index rised after6-OHDA using.The EN1or TH positive neurons both decreased as time goes by,with the alterations of EN1earlier than TH,which might suggest that the apoptosis of dopaminergic neurons and clinical symptoms of PD related to the reductions of EN1protein to some extent.
Author's address Dept.of Rehabilitation，Southwest Hospital of the Third Military Medical University,400038 Key word Parkinson's disease;transcription factor Engrailed1;tyrosine hydroxylase;dopaminergic neurons;
open-field test
偏心轮机构habi
醒后即出现自发的持续向实验侧（右侧）的旋转行为，向左向前不能，部分有躯体震颤等。之后运动功能逐渐恢复，7d 时已基本恢复正常。运动总量自术后呈逐渐恢复的趋势，但与对照组相比无显著差异（P ＞0.05）。中央区域活动时间逐渐减少，7d 时较正常组出现显著性差异（P <0.05），反映了焦虑指数的增高（表1）。
2.2模型小鼠中脑的形态学表达
观察部位为中脑最前端变化最明显处，以实验
侧阳性细胞占对照侧的百分比表示。
2.2.1实验侧的中脑EN1免疫阳性细胞数随时间逐渐下降：与对照侧相比，6-OHDA 注射后实验侧中脑黑质和腹侧被盖区转录因子EN1阳性细胞数明显减少，并随着注药时间的推移呈进行性减少（图1，表
2）。实验侧3h 时EN1表达已有所下降；6h 和9h 时继续减少但并不特别明显。12h、15h 和18h 时，EN1的表达则显著下降，至21h 时达到最低。EN1在中脑主要表达于胞核，也少量表达于胞浆。EN1阳性细胞主要分布于中脑黑质和腹侧被盖区的DA 能神经元区域，但在其他区域的部分神经元中也有较多表达。
2.2.2实验侧的中脑TH 免疫阳性细胞数随时间逐渐减少，但略晚于EN1：与EN1阳性细胞一样，实验侧中脑最前端部位的黑质与腹侧被盖区的TH 阳性
细胞数在6-OHDA 注射后也随时间而逐渐减少（图1，表2）。6—12h 时实验侧与对照侧TH 阳性细胞数量相当，所以未继续追踪3h 变化。15h 时变化仍不显著，18h 和21h 时实验侧的TH 免疫阳性细胞数明显减少。TH 阳性细胞的减少略晚于EN1的减少。
图1
免疫组化及荧光染示注药24h 内中脑
EN1/TH 的表达（100×，苏木素染为400×）
↖
↖
↖
↖
18h 实验侧EN118h 对照侧EN1
苏木素复染-EN1（棕为免疫阳性反应，蓝为复染的细胞核）
荧光染-EN118h 实验侧TH 18h 对照侧TH
表1旷场实验结果
（x±s ）
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 注：模型组与对照组间比较P <0.05
5min 运动总路程（cm ）
模型组667.6956±82.7887749.8541±287.6018842.5658±236.4031880.1942±310.0103803.029±200.0901837.4223±95.53991082.843±273.4082对照组
850.7924±279.6691886.7299±148.36461339.119±337.08491092.938±168.92441035.078±92.5876957.1196±189.96551163.472±197.735
5min 中央区域活动时间（s ）
模型组13.584±10.5887.626±2.9745.546±1.4064.666±4.7685.266±8.3183±3.8033.148±2.961①
对照组10.546±3.97615.16±8.27610.762±6.5168.906±7.53610.066±9.4788.706±3.703
10.9624±4.956①
3
讨论
冷气机组
6-OHDA 是诱导建立PD 动物模型应用最普遍
的毒素之一，纹状体注射后可逆行性损伤DA 神经元[7]。我们在预实验发现，6-OHDA 注射1d 时，EN1阳性细胞与TH 阳性DA 神经元数量减少均已出现。因此为探讨注药后二者表达改变的规律，均在24h 以内取材。
中脑-纹状体系统是锥体外系的重要组成部分，旷场实验中模型组小鼠行为学的改变可能与黑
表2注药24h 内中脑EN1/TH 表达比较
(x±s )
目标蛋白
EN1TH ①与正常成年小鼠比较P <0.05
3h
87.7±0.4未测6h
78.8±13.0①90.1±6.812h 77.3±19.0①
74.1±27.7①
18h
65.2±22.3①68.3±1.2①
Chinese Journal of Rehabilitation Medicine
质-纹状体系统DA神经元变性缺失及DA水平下降有关[5，8]。模型组焦虑指数也较正常组增高。以上均提示，EN1以及DA神经元的改变，可能与PD患者临床症状、抑郁等的出现存在一定关系。
EN1与PD的发生发展密切相关。EN1基因突变被认为是PD的危险因素之一[9]。从胚胎到成年期EN1在中脑DA神经元中呈特异性表达[10]。EN1对于DA神经元的发育和功能维持是必需的，并对DA 神经元具有独特的神经保护作用[6,11]。我们的6-OHDA模型小鼠实验侧中脑黑质和腹侧被盖区EN1表达下降，阳性细胞数量随注药时间的延长呈进行性减少。作为转录因子的EN1主要呈胞核表达，但我们同样也观察到了EN1在部分神经元中明确的胞浆表达，少量神经元中呈核浆双表达。近年来EN的胞外作用逐渐被揭示。EN1蛋白绝大部分分布于细胞核，约5%位于胞浆[12]；并可作为细胞间多肽信号被细胞分泌和内摄[13—15]。我们的结果符合这一理论。
本结果表明，注药后实验侧TH阳性DA神经元发生凋亡，细胞数量也呈进行性减少，15h后才逐渐达到显著性差异。目前认为，PD发病机制与线粒体损伤、蛋白质聚集等相关，导致DA神经元的不可逆性凋亡和纹状体系统DA水平下降，进而出现PD临床症状[16]。
我们发现，纹状体注射6-OHDA后，TH下降与EN1下降相一致且EN1表达减少早于TH阳性DA 神经元的减少，证明了EN1是DA神经元存活的维持因子之一，也提示转录因子EN1的表达下降可能与DA能神经元的凋亡有着密切关系；模型小鼠行为学的改变也提示EN1与PD临床症状的出现可能存在一定关
系。但EN1如何参与了DA神经元损伤及PD发生，是否参与了线粒体损伤等异常过程，仍然不清楚。关于二者相互关系的揭示及EN1未来是否可用于PD康复过程中的临床干预，仍需要大量更深入的研究。
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