对流免疫电泳实验报告
【篇一：实验十一免疫电泳】
免疫电泳技术
抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（igm类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。 当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶
解的现象。这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。贺育民
图1的位置
抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。这种结合也是相当稳定的。在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。解离后的抗原、抗体的活性一般保持不变。
双向免疫扩散测定法
原理
双向扩散法(double diffusion)又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用可电梯试验塔
使
分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小，分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原，诊断疾病。此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。
操作方法
（一）制备离子琼脂板
用10ml量筒，量取4ml融化的离子琼脂，倒在玻璃片上，待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。
镀锌铁丝生产设备 图2的位置
打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧。
（二）稀释抗原和抗体
采用2倍连续稀释法。将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23?方式连续稀释。方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）一份，在于第一管中加入抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出一份加入第二管中,如此依次稀释到最后一管。其稀释倍数依次是：2，4，8?。
（三）加样
将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。加样后置大培养皿内（皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度）。盖好皿盖，于24—37℃温箱内保温24—48小时。扩散后可出现清晰的沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效价。
（四）染及保存
经染后可提高沉淀线的可见度。
1. 漂洗琼脂板：将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐水2次以洗 去未结合的抗原或抗体。生理盐水浸泡后，更换蒸馏水浸泡1天，换水2次以除去盐分。琼脂板较脆易破，操作需小心。
静止轮毂 2. 干燥：取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。
3. 染：将琼脂板置于染剂（0.05%氨基黑10b）中浸泡，约5分钟（*注意观察染深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜为度。脱后滴加少量5%的甘油至琼脂板上，置室温干燥保存。如欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染剂、脱剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。
本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉淀线的观测、且重复性差，必须做净化处理后方可使用。
琼脂凝胶和玻璃片结合不紧密，样品可从样品孔下泄漏；在观察、漂洗时凝胶易于脱落。为防止上述现象，可将玻璃板进行处理，方法是用0.1%~0.2%琼脂均匀
涂布在玻璃板上，自然干燥后再进行双向扩散实验。
在抗原、抗体单一体系中，抗原浓度不同，沉淀线特征不同。如图3所示
图3的位置
抗原与抗体之间相对浓度不同，出现的沉淀线特征亦不同，如图4所示
在抗原、抗体多种体系中，抗原与相应抗体出现的沉淀线有多条，彼此互部干扰，如图5 所示
图4
图5
试剂和器材
1. 1.5%离子琼脂
（1） 琼脂的净化：高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则需要净化处理。
取30克优质琼脂加970ml h2o，加热至琼脂全部融化，即成3%的琼脂。用
食物模型
三、四层纱布热过滤，滤液流入一个搪瓷盘内，凝固后，切成1cm见方的小块，放在大容器中，将自来水同到容器底部，流水冲洗3天。冲洗时于容器上捆好一层纱布，以防琼脂块顺水冲走。然后用蒸馏水浸泡2~3天，每天换水2~3次。琼脂块净化后即浸没于蒸馏水中，加万分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。
（2） 离子琼脂的制备：离子强度0.06，ph8.6缓冲液：称取10.3g
取净化的3%的琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度0.06，ph8.6的缓冲液，加热混匀，即成为离子强度0.03，ph8.6，1.5%离
子琼脂。在制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞防腐。
琼脂中的缓冲液，其离子强度最好比电极槽中的低1/2，这样可以避免在电泳时因电流过大引起琼脂变形（凸凹不平）。
2.
3.
4.
器材
1.
2.
3.
4.
5.
6.
微量免疫电泳
原理
免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测方法（双向扩散）结合起来的检测方法。它提高了分辨率和灵敏度，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。微量免疫电泳所用的样品和抗血清较少，而且测定时间短，灵敏度高，因此应用比较广泛。
在倒有离子琼脂的饿玻璃片的中心挖一长槽，槽的两侧个挖一个圆孔，孔内加入待测样品，如图6a所示。
电泳时，样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性质各异，因而
被分离成几个区带（如图6b所示）。电泳后在中央槽中加入相应抗血
清，置37℃扩散。被分离的蛋白质与相应抗体形成大小不同、深浅各
异的沉淀弧（如图6c、d所示）。一般情况下，每一沉淀弧即代表蛋
白质混合液中的一种成分，以此定性或半定量。
图6
操作方法
铃木秀一（一） 制备离子琼脂板
将前述实验的离子琼脂加热融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后 按图7所示打孔和打槽，用注射器针头将孔内琼脂挑出。槽内琼脂在电泳分离以后在挑出，以免电泳时横槽变形影响双向扩散。
图7
（二） 电泳
于两个电泳槽中防入离子强度为0.06，ph8.6的缓冲液。将琼脂板平置于两个电极槽之间，为使电路连通，于缓冲液的液面到琼脂板之间，用单层滤纸或纱布搭桥形成通路，接通电源加10v电压，用小滴管取样品注入琼脂板孔内，假样量与孔平或稍少，调电压至100~150v，通电40~60分钟，当血清中素泳动到距边缘约1.5cm时，断电，取出琼脂板，用注射器针头将横槽中的琼脂挑出，加抗血清，水平置于湿盒（或培养皿中），于37或24进行双向扩散24-48小时后，取出观察实验结果。
（三） 染
参看双向免疫扩散法实验。
在免疫电泳实验中的琼脂电泳分离法，可用其他蛋白电泳技术代 替，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳法等。电泳后切下相应的胶带置于玻璃板上，倒上离子琼脂。
当凝胶与胶带紧密帖在一起并凝固后，在距胶带约0.5cm处打横槽，挑出琼脂，加抗血清进行双向扩散。由于不同电泳方法对蛋白质抗原的浓度要求不同，要根据抗原、抗体沉淀反应的合适比例稀释抗血清。
沉淀弧的曲度大，说明该种蛋白质的含量较高，电泳时扩散也较为严重之故。曲度对称说明蛋白质分子均一，不对称似直线或直线上有小弧，说明蛋白质分子不均一。
电泳时一般稳压在100~150v范围，电流可用凝胶板两侧滤纸桥
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