中国科学院亚热带农业生态研究所莫继荣
植物外植体接种与转管继代培养操作主要是在无菌室内完成，其关键技术是无菌、避免污染。作到了外植体灭菌彻底、接种操作要领得当，很少有污染(5%左右)，解决了植物组织培养三大难题之一，植物组织培养技术掌握了一多半。 外植体指植物组织培养组织的外界来源体。当然培养容器内长成的植株也可以作外植体，这样省去外植体灭菌程序，更方便，但其初次来源还是外界植物组织，放入转管培养概念比较合适。 转管继代培养指在盛培养基容器内植物体生长一段时间后(1个月左右)，由于培养基失水干结、容器内植株过于密集、培养基养分消耗干净、培养基累积代谢有害物质过多，需要将生长在容器内的植物体转到新的培养基上重新生长。在完成一系列的转管培养过程中，植物体得以完成分化(形成愈伤组织)、再分化(愈伤组织分化成植株)、快速繁殖，达成植物组织培养的目标。
一、外植体采样与初处理
1、植物组织培养及其应用原理
植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性，即植物体内每个细胞含有该植物种性的全部遗传基因密码，在离体培养时加入足够养分与激素控制，能生长成一株完整植株。利用这一基础理论，许多珍贵物种可以用植物组织培养进行大量扩繁。
在植物细胞离体培养时，发生基因诱导突变的概率往往高于自然突变，这是植物组织培养用于植物育种的原理。
植物生长点的生命活力很强，营腐生生活的植物病毒不能在其细胞内生存，所以取生长点足够小(小于0.5毫米)能够培养大量不含病毒的无性繁殖植物母株，进行品种的提纯复壮。
2、外植体采样与初处理
虽说植物单个细胞具有全能性，能长出一株完整植株，但在生产实际中，且不说单细胞培养，就是分生能力弱的老细胞组织也难以培养成新植株，所以植物组织培养的外植体采样关系到植物组织培养成功率。
按照植物组织培养目标不同与植物稀有程度不同，采样的部位也有差别。
用于培养常规作物脱毒母株的外植体，最好取其茎尖2-3厘米长。
电机智能监控器用于珍稀植物组织培养快速繁殖的，尽量不伤害原植株的生长，取其分生能力强的新叶(整片)、茎秆前端新茎(5厘米内为一段)、新根(5厘米内为一段)
精油与肌肤百度影音采样后的利用体就是组织培养的外植体。外植体因为外表粗糙、沉淀有污垢层、密集的绒毛包被，给外植体消毒带来难度。需要进行初处理。处理方法：用纱布蘸70%酒精外表涂抹后，放入自来水加洗洁精的容器中清洗，用清水漂洗干净洗洁精后，清理外植体成有序的叠层用纱布包好，用活结稍微扎紧纱布，放在烧杯中，放在自来水下冲洗30分钟左右，放入无菌室备用。角钉
二、无菌操作技术要点
1、硬件设施要求
无菌室要密闭，无与外界对流缝隙，每12平米房顶中央吸顶安装一盏90瓦紫外线杀菌灯；依靠空调过滤交换空气，空调过滤装置要常清污，安装在超净工作台上方，出风口不能正对人座的方向；要通过缓冲间进出无菌室，进缓冲间的门与进缓冲间进到无菌室的门不能再180度直线上，应成90度拐角，防止空气对流，缓冲间安装一盏90瓦紫外线杀菌灯，面积够挂白大褂、白帽子、口罩、防鞋子、一个人轮流进出，2-4平米即可；无菌室要求地板防潮、干燥，定期用新洁尔灭拖地、抹窗户消毒。
2、进无菌室前操作细节银行复点机
进无菌室操作之前，灭菌好的培养基和高压灭菌锅消毒的无菌水、玻璃器皿、刀具、镊子等用品，待接种的外植体或转管材料搬进无菌室；检查酒精灯酒精、70%消毒酒精、外植体灭菌消毒液是否够量，不够补充好；打开无菌室、缓冲间、超净工作台紫外灯(不开通风)20~30分钟；灭掉所有紫外灯，迅速打开无菌室空调和超净工作台通风机，敞开缓冲间进无菌室的内层门，关闭进缓冲间的外层门，空调换气15分钟后，可以开始无菌室操作。
3、进无菌室操作细节打开缓冲间外门，人迅速进入缓冲间，并随手关门，并拉拢进入缓冲间门，开始换上白大褂和进无菌室专用鞋、戴上口罩和医用帽，进入无菌室并随手关闭内层门。
发泡技术
4、超净工作台上无菌操作细节上到超净台，先用70%酒精棉对双手进行擦拭消毒，然后用70%酒精棉对超净台五个面和台面上未经高压灭菌锅消毒的容器表面进行擦拭消毒。依次解开需要用的、高压灭
菌锅消毒过得镊子、培养皿、烧杯、无菌水外包装；镊子插入盛有70%酒精的容器中浸泡，随时备用；培养皿、烧杯、无菌水外包装在需要用的时候，随解随用；点燃酒精灯。
4.1外植体接种在超净工作台上无菌操作细节
外植体接种操作流程：外植体无菌室消毒→分离→接种→进培养室。外植体无菌室消毒技术要点：在
70%酒精中浸泡10秒，马上放入0.1%浸泡2—10分钟(在所有灭菌液中，穿透和灭菌效果最强，但对外植体细胞的杀死作用也最大，外植体为柔嫩多水组织浸泡时间要短；外植体为包被严密、组织结实浸泡时间要长)。
从液中取出外植体放入50-100ml灭菌烧杯中；在酒精灯附近用左手小指和无名指握住无菌蒸馏水三角瓶棉塞顶部，右手掌面握住500ml三角瓶底部，抽出棉塞；三角瓶口在酒精灯火焰外围转动一卷后，倒无菌蒸馏水到外植体烧杯中约80%满度；棉塞、无菌蒸馏水三角瓶在酒精灯火焰外围转动一卷；将棉塞塞回三角瓶；右手从70%酒精容器中镊子(一般用“Z”形镊子操作较方便)，在火焰上烧干酒精，用镊子扒动包外植体的纱布，夹起纱布放到另外一个50-100ml 灭菌烧杯中，放回镊子，倒掉烧杯冲洗过外植体的无菌蒸馏水到一个500ml高温灭菌的三角瓶，移走倒水后的小烧杯至超净台面外。如此往复三次冲洗干净残留。完成冲洗后的外植体放入高温灭菌的直径12厘米的培养皿中，盖上盖备用。
外植体分离技术要点：揭开盛消毒过外植体培养皿盖，盖底朝上放在超净台面上，用酒精灯上烧过的镊子，左右手各一把揭开纱布露出外
植体，以后每次从盛外植体培养皿中取出够接种3-5瓶的外植体，并马上加盖，防止外植体干枯。
茎尖快速繁殖的外植体分离技术要点：取70%酒精棉将整个双目解剖镜的外表全部擦拭一遍，取高温
灭菌直径12厘米的培养皿(一个培养皿在不同位置剥3-5个茎尖)于解剖镜台面，每次从盛外消毒过植体培养皿中取一个茎尖外植体，在40~80倍双目解剖镜下，左手用镊子夹住外植体尾端、右手用解剖针(尖细且锋利)剥掉茎尖外包被层，直到露出茎尖生长点时，用解剖针划下茎尖长0.3-0.5毫米部分，用解剖针粘住划下的茎尖，接种到培养基上。
茎、叶、根外植体分离技术要点：从盛消毒过外植体培养皿中取够接种3-5瓶的外植体于高温灭菌的直径12厘米的培养皿中，左手用镊子夹住外植体、右手用眼科小剪刀剪掉外植体外围部分2-3毫米(造成坏死)，再剪成0.3-0.5厘米×0.3-0.5厘米小块备用。
一氧化氮 笑气外植体接种技术要点：揭开盛培养基容器瓶盖(或封口牛皮纸与硫酸纸)，盖底朝上，放于超净工作台面上；是加棉塞的，左手掌面握住培养基容器底部，右手小指与无名指握住棉塞顶部，在酒精灯火焰外围抽出棉塞，并在酒精灯火焰外围转动容器口部一周，容器口一直保持在酒精灯火焰外围；用烧干酒精的镊子，先在容器的培养基上插入冷却，夹起分离好的外植体，放入容器培养基上1-5个外植体(外植体来源稀有珍贵的少放，避免交叉感染) ，呈中央1点，或中央均匀2点，或中央等三角形，或中央正方形，或中央梅花形排列，外植体紧贴培养基，外围吃入培养基中少许以利吸取养分；容器口(棉塞)在
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