高考生物二轮专题复习
【知识脉络】
基因工程的操作对象是DNA分子，利用限制酶、DNA连接酶、载体等进行基因工程的操作，基因工程在农牧业、医药卫生、食品工业等方面有广泛的应用，在基因工程的基础上，崛起了第二代基因工程—蛋白质工程。 (对照课本回顾主干知识)
【重要概念检测】
[例1] (2020·北京等级考)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( ) A．①高压电源设计＋③ B．①＋②
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C．③＋② D．③＋④
答案 B
解析 PCR扩增时，由于子链延伸方向为5′端到3′端，因此应在模板DNA两条链的3′端分别设计一个引物，A错误；为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者扩增获得的DNA片段只要既包含外源高效启动子序列又包含HMA3基因的序列，便可在检测是否有HMA3基因的同时，又可排除内源HMA3基因的干扰，若用③独角架＋②或③＋④引物组合进行PCR扩增，扩增获得的HMA3基因不包含外源高效启动子序列，C、D错误；若用①＋②或①＋④引物组合进行PCR扩增，获得的DNA片段符合要求，B正确。
[例2] (2022·北京海淀期末)乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD热轧螺纹钢)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L－PG)，可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如图所示。下列关于该过程的分析不合理的是( ) A．转入的L－PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性
B．可以利用PCR技术筛选含有L－PG服务器审计
基因的受体细胞 C．通过同源重组实现酵母菌的PD基因被替换为L－PG基因
D．标记基因Amp′可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
答案 D
解析 酿酒酵母质粒上的PD基因替换为L－PG基因前后，标记基因Amp′均正常，故标记基因Amp′不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株。
[例3] (多选)下列关于生物工程中常见的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA
B．限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
C．在进行基因工程操作中，天然质粒需经过人工改造后才能作为载体
D．利用酶解法处理植物细胞获得原生质体，便于进行植物杂交育种
答案 BC
解析 DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端或平末端的磷酸二酯键黏合，形成重组DNA，A错误；限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段，即断裂两个磷酸二酯键，因此需消耗两个水分子，B正确；在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确；用酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物细胞融合，属于植物体细胞杂交技术，植物杂交育种一般是通过杂交的方式获得所需的子代，D错误。
[例4] (2021·全国乙卷改编)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中______________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。鸡眼镜
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________。
答案 (1)EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
(2)磷酸二酯键
(3)自我复制 一至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
解析 (1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶连接，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)用T4 DNA连接酶连接。
[例5] (2021·广东选择考适应性测试)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术，将人的亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外显子(其中含150个CAG三核苷酸重复序列)“敲入”猪基因组内，获得了人—猪“镶嵌”HTT基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列
问题：
(1)PCR技术是获得人HTT基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲溶液中分别加入人HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸及________________________________等，最后补足H2O。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于________酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性决定了其具有__________________________的局限性。
(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人—猪“镶嵌”HTT基因，常用的检测手段包括PCR技术及____________________。
(4)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加，当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为________。贴满瓶壁的细胞常用________进行消化处理，以便进行传代培养。
(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为________________。此后进行体外胚胎培养并移植到母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。
答案 (1)引物、耐高温的DNA聚合酶
(2)水解 只能识别并切割特定核苷酸序列
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