13生物技术第二大组第二小组
组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：
在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一
种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观
拖布为白至浅黄的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无或淡黄，有时呈乳白；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶
的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）
为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键，且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）
溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用，是一类巯基蛋白酶, 广泛地存在于番木瓜的茎叶和果实中, 未成熟的乳汁中含量最高.因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强, 对多种蛋白质均具有很好的降解作用, 目前
水质改良已被广泛应用于各个行业.在食品中, 木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中.由于此酶为纯天然产物, 其开发前景广阔.运用蛋白质分离纯化的一般方法可将其制备出来并进行活力鉴定。 三、木瓜蛋白酶的提取
1、过去的常规提取方法
（1）、烘干法：
在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。
（2）单宁沉淀法：乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。
2、目前较为常见的提取方法无菌车间
压铸机料筒的设计（1）、超滤法：谭晶等用超滤技术分离木瓜蛋白酶。先将中空纤维超滤膜洗净，经过处理后，控制一定压力和流量，进行超滤。木瓜蛋白酶是大分子物质，在超滤过程中被截留，而水及小分子杂质透过膜，从而达到分离和纯化的目的。实验结果表明，超滤后木瓜蛋白酶的活力是超滤前的1.22倍，蛋白质含量为超滤前的2.8倍，说明超滤后木瓜蛋白酶的纯度有所增加。但由于木瓜蛋白酶属于大分子物质，在超滤过程中会在膜表面聚积而产生浓差极化现象，使超滤速率逐渐下降影响酶得率。营业执照镜框
（2）、盐析法：王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析，然后调pH值，离心取沉淀，干燥，得酶产品。实验结果表明，用该法制备的木瓜蛋白酶
纯度相对较高，酶的比活力达到了1184U/mg，适宜作为化妆品成分。但这种方法由于用了大量的盐，使酶中灰分增加，同时降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，盐析法并不是理想的木瓜蛋白酶提取方法。
（3）、絮凝法：絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物，从而使酶从溶液中沉淀析出。何继芹等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白酶。实验结果表明，在适宜的条件下进行絮凝处理，可使木瓜蛋白酶在这步的收率达95～97%。但这种方法提取专一性不强，制得的木瓜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高。
箱包提手（4）、超声波法：超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取。超声波产生的空化效应，一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输，另一方面破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放，从而强化了提取过程。超声波形成的微射流效应也是提高提取率的一个重要原因。肖贵平曾用超声波法提取木瓜蛋白酶。选择新鲜的番木瓜，清洗后切块破碎，称取果肉，打浆；果浆在一定条件下进行超声波处理，离心、除杂、过滤后，上清液进行超滤浓缩，收集酶液样品。结果表明：超声功率300W，超声时间200s，果浆质量分数30%，这时酶活力是未经超声波处理的1.71倍。采用超声波提取工艺得到的粗酶液的含量较低，含有较多杂质，经膜分离初步纯化浓缩后，还需作进一步纯化处理，这有待于进一步深入研究，以提高酶的活性和纯度。
（5）、亲和膜谱法：亲和膜谱技术是一种20世纪80年代末发展起来的生物大分子分离纯化的新技术，把膜分离与亲和分离结合起来，使之兼具膜分离与亲和分离的特点。聂华丽等以尼龙膜为基质，键合壳聚糖进行表面改性处理，以降低尼龙膜的非特异性吸附，并偶联染料配体Cibacron Blue F3GA，得到一种新型的亲和膜谱材料，并用其对木瓜蛋白酶进行分离。结果表明，该亲和膜具有良好的谱性能，对木瓜蛋白酶有较高的吸附量（235.3mg/g），使用该亲和膜对木瓜粉中的木瓜蛋白酶进行分离纯化，纯化倍数可达46.5倍。亲和膜谱与传统的膜分离、亲
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