墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物活性材料领域，涉及一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法及应用。

背景技术：

2.由于人体骨组织中主要无机成分为羟基磷灰石，临床常用的骨修复材料只有合成羟基磷灰石。但合成的羟基磷灰石在骨修复过程中缺少骨诱导和骨传导能力。近年来，利用各种天然生物材料合成的羟基磷灰石成为热点，例如利用鱼骨、珊瑚、牛骨等生物材料作为羟基磷灰石的生物钙源得到越来越多的关注。珊瑚和牛骨两者都是很好的骨修复原料，但珊瑚作为国家保护动物，难以在临床上实现大规模应用，牛骨有携带疯牛病病毒的风险，对人类的生命健康有潜在的威胁，所以寻求一种更为有效，更为安全，来源更为广泛的生物材料应用于骨修复领域是人们的迫切需求。
3.墨鱼骨本身含有sr
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、mg
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、si
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、cu
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、zn
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、fe
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等微量元素，研究表明，cu
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、zn
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具有抗菌性及促内皮细胞血管生成的功效，sr
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、mg
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、si
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、fe
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等微量元素有利于抑制破骨细胞的生成和促进成骨细胞的再生，在整体生理功能和骨结合过程中起着至关重要的作用。虽然，墨鱼骨源转化羟基磷灰石等已有研究，但是，墨鱼骨源获取含多种微量元素的ha/β-tcp双相磷酸钙盐未见报道。

技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种通过水热烧结两步法制备墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。该材料主要成分是与人体天然骨组织成分相似的β-tcp和ha，且通过第二步的煅烧可以调节ha/β-tcp双相的比例，从而获得修复材料理想的生物降解性、生物活性及生物诱导性能。
5.需要说明的是，本发明针对临床需要使用骨修复材料的患者，以期根据患者的年龄及骨质，个性化调节所使用修复材料中ha/β-tcp双相磷酸钙的比例，本发明提供了控制第二阶段的煅烧温度调控双相比例的方法，为实现可控的生物降解速率奠定了基础。
6.具体地，本发明通过控制第一阶段的水热反应体系成分和温度，获得含有缺钙型羟基磷灰石d-ha和capo3(oh)的前驱体；并通过第二阶段的煅烧，在高温条件下，d-ha和capo3(oh)会分解，生成β-tcp，且随着煅烧温度的升高，d-ha和capo3(oh)会分解得更多，β-tcp的含量增加，从而可以控制双相中ha和β-tcp比例，以期获得修复所需的骨组织成分和结构；此外，经水热烧结两步法处理后的墨鱼骨保留有促进骨组织生长、诱导骨形成的微量元素，如sr
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、mg
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、si
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、cu
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、zn
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、fe
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。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
9.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨成粉末过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；
10.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入并调节钙磷比，待滴定完成后搅拌并于高温高压条件下充分水热反应，得产物，备用；
11.(3)将步骤(2)水热处理后的产物进行固液分离、干燥后煅烧，即得到所述墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
12.可选的，步骤(1)中，离心转速为2500-6000r/min，离心时间为10-20min，煅烧温度为600-1000℃。
13.可选的，步骤(2)中的钙磷比为1-1.7，步骤(3)中的水热反应温度为100-200℃，反应时间为6-15小时；步骤(3)中的煅烧温度为600-1200℃，升温速率为10℃/min，恒温2-5小时。
14.需要说明的是，通过煅烧可以使碳酸钙转化为氧化钙；
15.且，水热温度为100-200℃时羟基磷灰石的含量增加，以及在600-1200℃温度下煅烧能获得ha/β-tcp双相磷酸钙。
16.本发明还请求经上述方法制备的双相磷酸钙材料，所述双相磷酸钙材料中含有圆形的β-磷酸钙颗粒β-tcp以及短棒状的羟基磷灰石晶须ha，其中β-tcp的质量百分比从5％变化到100％。
17.其中，所述的双相磷酸钙材料具有微纳米级孔结构，孔半径为100-1000nm。
18.以及，本发明还请求保护由上述方法制备的双相磷酸钙材料或如权利要求5所述的双相磷酸钙材料在制备骨缺损骨修复材料及骨组织工程中的应用。
19.还包括：所述的双相磷酸钙材料在制备骨植入物涂层材料中的应用，及所述的双相磷酸钙材料在制备药物载体的材料中的应用。
20.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供的一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料及其制备方法与应用，具有如下优异效果：
21.本发明通过调节水热后的煅烧温度可以调节材料中β-tcp和ha的比例，由此调节骨修复材料本身的生物降解速率、生物活性等；其中，β-tcp拥有较快的溶解速率，使其拥有良好的生物降解性及生物活性；而ha比β-tcp具有更高的机械强度和较低的降解速率，可以调节修复材料的力学性能等。针对病人的骨损伤位置及骨质，综合考虑ha/β-tcp复合比例，实现个性化设置，改善骨修复材料的物理、化学、力学及生物性能，调高骨修复材料的修复功能。
22.此外，本发明经过水热煅烧两步法后仍然保留墨鱼骨中促进骨修复的微量元素，这些微量元素以离子的形式存在，对骨组织的增殖、矿化和提高骨强度等方面发挥着重要作用。故本发明获得了一种成本低廉的墨鱼骨源的高值化骨修复产品。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
24.图1为水热煅烧两步法的反应过程图。
25.图2为水热煅烧两步法制备的墨鱼骨源双相磷酸钙活性骨修复材料的扫描电镜图。
26.图3在700℃、800℃、900℃、1000℃煅烧温度下获取不同比例ha/β-tcp复合材料的xrd图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明实施例公开了一种墨鱼骨源双相磷酸钙活性骨修复材料的制备方法。
29.为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
30.下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
31.实施例1
32.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；
33.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比；
34.(3)待滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，并将水热处理后的产物进行固液分离、烘干后置于中温炉中900℃下煅烧2小时，即得到墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
35.实施例2
36.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；
37.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比；
38.(3)待滴定完成后，30℃下继续搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，并将水热处理后的产物进行固液分离、烘干后置于中温炉中1000℃下煅烧2小时，即得到墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
39.实施例3
40.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；
41.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比；
42.(3)待滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在110℃水热处理10h，并将水热处理后的产物进行固液分离、烘干后置于中温炉中900℃下煅烧2小时，即得到墨鱼
骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
43.实施例4
44.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；
45.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比；
46.(3)待滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在150℃水热处理10h，并将水热处理后的产物进行固液分离、烘干后置于中温炉中900℃下煅烧2小时，即得到墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
47.此外，为进一步说明本发明技术方案，发明人分别对实施例制备的材料进行形貌与晶相测定，具体如下：
48.如图1所示，墨鱼骨与磷酸在第一阶段水热反应中获得制备双相钙磷盐所需的前驱体，第二阶段随着煅烧温度的升高，β-tcp相逐渐增加，可以获得不同比例的ha/β-tcp，上升到一定的温度时，水热过程所获得的前驱体全部转化为β-tcp。
49.并由图2可知，经高温煅烧后粉末颗粒呈椭球状，出现大量的烧结颈，且具有微纳米级孔结构；以及图3为实施例水热煅烧后及不同煅烧温度下粉末的xrd图，由图3可知，粉末的主要成分为ha和β-tcp，随着煅烧温度的升高，β-tcp在双相中的占比增大。
50.以及，为进一步描述所制备的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性材料的具体应用，发明人还进行了如下应用实验，具体内容如下：
51.实验例1：利用墨鱼骨作骨粉填充剂的制备方法
52.(1)清洗块状墨鱼骨，切割成若干个小块，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，将样品烘干后煅烧备用。
53.(2)将处理好的墨鱼骨块浸泡在蒸馏水中，充分反应后加入适量磷酸。
54.(3)浸泡3小时后，至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，将水热处理后的产物进行固液分离。
55.(4)烘干后于中温炉中1000℃煅烧2小时。
56.(5)研磨后分别过20目，10目的筛子，获得1-2mm的墨鱼骨骨粉。
57.(6)将peek、pla、plla、plga、pva或pcl和步骤(5)所得的墨鱼骨粉末复合，获得复合骨粉填充剂。
58.实验2：温喷涂ha/β-tcp涂层的制备方法
59.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，将样品烘干后煅烧备用。
60.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比。
61.(3)滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，将水热处理后的产物进行固液分离。
62.(4)烘干后于中温炉中900℃煅烧2小时。
63.(5)采用ch-2000型超音速火焰喷涂系统，进样，调节喷涂参数丙烷压力为0.4mpa，流量为15slpm，氧气压力为0.5mpa，流量为60slpm，氮气压力分别为0.6mpa，流量为40slpm，
喷移动速度为1500mm/s，喷涂距离为30mm，获得ha/β-tcp/ti基体骨修复材料。
64.实验3：ha/β-tcp材料负载黄芩苷的制备方法
65.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，将样品烘干后煅烧备用。
66.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比。
67.(3)滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，将水热处理后的产物进行固液分离。
68.(4)烘干后于中温炉中900℃煅烧2小时。
69.(5)使用pbs配制100-1000μg/ml的ba溶液，取3ml配制的黄芩苷溶液放入塑料ep管，称量5mg步骤(4)所得的粉末加入溶液中并密封容器，置于恒温培养振荡器中震荡24h，离心后取沉淀冷冻干燥可得到负载有载ba的ha/β-tcp材料。
70.实验4：骨修复3d打印支架材料的制备
71.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，将样品烘干后煅烧备用。
72.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比。
73.(3)滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，将水热处理后的产物进行固液分离。
74.(4)干燥后于中温炉中900℃煅烧2小时。
75.(5)将peek、pla、plla、plga、pva或pcl和步骤(4)所得的粉末分别浸泡在乙醇溶液中，分别磁力搅拌30min，超声处理30min，随后将制得的混合液以1：1比例混合，并通过磁力搅拌1h，超声1h后，通过过滤收集混合物粉末，用去离子水洗涤，在60℃干燥。，使用选择性激光烧结(sls)制作支架；且粉末的激光烧结采用光斑直径为500μm，扫描速度为120mm s-1，扫描线间隔为950μm，层厚0.1mm～0.2mm；待烧结完成后，去除脚手架，用吹制压缩空气去除未烧结的粉末。
76.实验5：利用海绵浸渍法制备多孔ha/β-tcp陶瓷材料
77.(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，将样品烘干后煅烧备用。
78.(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入悬浊液中，调节钙磷比。
79.(3)滴定完成后，搅拌3小时，然后至于水热反应釜中，在180℃水热处理10h，将水热处理后的产物进行固液分离。
80.(4)干燥后于中温炉中900℃煅烧5小时。
81.(5)将步骤(4)所得的粉末和高温粘结剂(p2o5、na2o、mgo、alpo4、cao)按85：15重量比例混合，加入适量的蒸馏水球磨10h，制得料浆，加入h3po4，调节ph值至弱酸性。再将已剪裁好的高弹性聚胺脂海绵浸渍浆料，在80℃下烘干，最后于880℃保温烧结成多孔ha/β-tcp陶瓷材料。
82.实验6：骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药
物释放载体的体外细胞毒性实验
83.本研究所使用小鼠成骨前细胞mc3t3-e1，是在含有10％胎牛血清(hyclone)、100u/ml青霉素(amresco)、100μg/ml链霉素(amresco,cleveland,oh)的mem培养基(hyclone,logan,ut)，在37℃，5％二氧化碳的潮湿环境中培养的。
84.使用mtt测试评估骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体对于mc3t3-e1细胞的毒性，具体实验操作过程如下所述：
85.材料的细胞毒性：将mc3t3-e1细胞接种于24孔板中，密度为0.5
×
104，24小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次；将骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体样品以比例为100、150、200μg/ml放置在24孔板中，每组各1个样品；在37℃分别孵育1天后，去除培养基，加入浓度为5mg/ml的mtt，在37℃的培养箱里面再培养4小时；吸出mtt工作液，每孔加入适量dmso，并在摇床上孵育10min，将每个孔dmso分到3个96孔板中；使用酶标仪在490nm处测量吸光光度值。
86.live-dead染分析：将灭菌后的骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体在pbs缓冲液中浸泡24小时，取出后将其继续浸没于完全培养基中，在细胞培养箱中浸泡24小时。将bmscs接种在骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体表面培养3、5、7天后，对bmscs进行live/dead染，采用钙黄绿素/碘化丙锭(calcein-am/pi)双荧光染法观察细胞的存活情况。染步骤如下：1)取10μl calcein-am(1mg/ml)和15μl pi(1mg/ml)于5mlpbs中，配制为染工作液避光待用；2)取出骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体，弃培养液，用pbs冲刷3次，加入适量染液浸没细胞。避光孵育20min后，再次用pbs冲刷3次；3)设置激发光波长为488nm和561nm，在lcsm下，观察细胞在支架表面的生死状态，红荧光是凋零细胞，绿荧光为铺展的活细胞。
87.实验结果表明，骨粉填充剂、ha/β-tcp涂层材料、骨修复3d打印支架材料、ha/β-tcp用作药物释放载体时均无细胞毒性。
88.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：(1)清洗块状墨鱼骨，烘干后研磨成粉末过筛，在30％h2o2溶液里浸泡24h后，将产物进行固液分离，并将样品烘干后煅烧备用；(2)称取适量样品溶于去离子水中，超声分散，缓慢地将磷酸滴入并调节钙磷比，待滴定完成后搅拌并于高温高压条件下充分水热反应，得产物，备用；(3)将步骤(2)水热处理后的产物进行固液分离、干燥后煅烧，即得到墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。2.根据权利要求1所述的一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，离心转速为2500-6000r/min，离心时间为10-20min，煅烧温度为600-1000℃。3.根据权利要求1所述的一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的钙磷比为1-1.7，步骤(3)中的水热反应温度为100-200℃，反应时间为6-15小时；步骤(3)中的煅烧温度为600-1200℃，升温速率为10℃/min，恒温2-5小时。4.一种如权利要求1所述方法制备的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料，其特征在于，所述墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料中含有圆形的β-磷酸钙颗粒β-tcp以及短棒状的羟基磷灰石晶须ha，其中β-tcp的质量百分比从5％变化到100％。5.根据权利要求4所述的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料，其特征在于，所述的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料具有微纳米级孔结构，孔半径为100-1000nm。6.一种如权利要求1所述方法制备的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料或如权利要求5所述的墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料在制备骨缺损骨修复材料及骨组织工程中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，还包括：所述墨鱼骨源双双相磷酸钙活性材料在制备骨植入物涂层材料中的应用。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，还包括：所述墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料在制备药物载体的材料中的应用。

技术总结

本发明属于生物活性材料领域，涉及一种墨鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法。本发明以墨鱼骨为原料，通过水热烧结两步法制备出一种具有生物活性的骨修复材料，其主要成分是β-磷酸三钙β-TCP和羟基磷灰石HA。经水热烧结两步法处理后的墨鱼骨保留有促进骨组织生长、诱导骨形成的微量元素，如Sr

技术研发人员：

李萌婷 冼家如 刘朝宗 尹学琼 曹夏馨 张畅泽 郑晓非

受保护的技术使用者：

海南大学

技术研发日：

2022.07.22

技术公布日：

2022/11/11