植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法
1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将 同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单水位显示器,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测结核杆菌蛋白芯片,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1] 、快速ELISA 等。
1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA)
快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV adma的灵敏度分别可达5ng/ml～50ng/ml 。
1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say)
免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领
域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。
随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简易快速的胶体金免疫层析试验( Gold immuno-chromatography assay) ,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透移动,在移动的过程中,抗体抗原发生反应,并通过免疫金的颜显示出来。上述两种快速检测技术的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。但不能准确定量,灵敏度与酶联相当。魏梅生等
[5～6] 应用该技术成功地进行烟草环斑病毒的检测。
1．4 免疫毛细管区带电泳( Immuno-capillary zone electrophoresis , I-CZE)
毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。在外加电压作用下,通过电泳迁移和电渗流的作用,样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。I-CZE将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来,实时检测抗原- 抗体复合体Eun[7 ] 等应用I-CZE检测到10fg 建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。I-CZE 灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。
1．5 免疫PCR
近年来出现的免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术,与酶联检测技术相比,免疫PCR 是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用PCR 扩增DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。Sharman[8]建立的复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶
病毒。
1.6 沉淀法
在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型形成沉淀也不同。如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测定病毒溶度。
1.7 补体结合测定法
血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分称为补体。它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。
2 以病毒核酸为基础的检测方法
2．1 多聚酶链式反应(PCR)
PCR 是Mullis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。其基本原理是:以待扩增
的DNA 样品为模板,两个分别与待扩增DNA 片断正链和负链互补的DNA 片断为引物,在DNA 聚合酶的催化下,快速体外扩增特异DNA 序列。在反应过程中,前一轮扩增得到的DNA 又作为后一轮反应的模板,因此DNA 的量迅速增加,一般经过大约30次循环反应,DNA 的量可扩增100 万倍以上。对于DNA 病毒可以直接进行扩增,而对于大多数的RNA 病毒,则需先将RNA反转录成cDNA 再进行PCR 扩增, 此方法称RT2PCR(Reverse transcription-PCR) 。用PCR 检测植物病毒所需时间短,灵敏度特别高。用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg[10]。近年来,在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。如复合PT2PCR 是在同一RT-PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段;PCR-ELISA 是用ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,灵敏度高。Olmos 等[12]用PCR2ELISA 方法检测李痘病毒的灵敏度比免疫PCR 高100 倍。
2．2 分子信标(Molecular beacon)
分子信标[13 ] 是具有茎环结构的一段单链核酸分子,5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”,与目标序列互补的探针序列为“环”,在5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分。反应开始时先将反应液加热到80 ℃,这时分子信标变性,无茎环结构,不管有无目标序列均有荧光。当温度逐渐
降到20 ℃时,连续检测其荧光强度。如果反应中产生与分子信标互补的目标序列,当温度降到解链温度时,分子信标和目标序列杂交,荧光部分从猝灭部分移开,从而发出荧光。如果反应中没有目标序列,分子信标的两臂相遇形成茎环结构,不会产生荧光。由于只有与互补序列杂交后分子信标才发出荧光,未杂交的信标不发荧光,因此不需要从反应混合物中除去未杂交的分子信标,g3网络可实时定量检测,灵敏度高。
2．3 TaqMan实时定量PCR ( Real-time RT-PCR)
TaqMan实时定量PCR 是将RT-PCR和荧光检测相结合,利用TaqDNA 聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。探针5′- 端连接荧光组分,3′- 肽链内切酶端连接猝灭组分,当探针完整时,无荧光出现。在PCR 过程中,荧光探针(也称TaqMan探针) 专化性地与两引物扩增产物间的一段序列退火后被TaqDNA 聚合酶切割,荧光组分与猝灭组分分开,产生荧光信号,荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成比例。在每一循环中,都会有更多的分子被切割下来,荧光强度呈指数增长。TaqMan实时RT-PCR不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,并且可在一个反应管内完成,减少了污染,反应自动完成, 易定量。应用该技术, Roberts等[14]成功检测少至500fg 的番茄斑萎病毒,Eun 等[15] 同时检测少至5fg 的建兰花叶病毒和齿兰环班病毒。
2．4 核酸杂交技术(Nucleic acid hybridization)
核酸杂交是两段具有一定的同源性、来源不同的核酸分子在去掉变性条件后,互补的区段退火形成异质双链分子的过程。核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上,然后用核酸探针与其进行杂交,使杂交体带上标记而被显示出来。一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒,直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。核酸杂交技术适用于DNA 病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg 的DNA。朱水芳等[16] 、李尉民等[17]分别应用核酸杂交成功检测了番茄环斑病毒和南方菜豆花叶病毒。核酸杂交还可和RT-PCR 结合使用,Bertolini 等[18] 采用复合RT-PCR 同时检测侵染橄揽树的6 种RNA 病毒,随后用这6 种病毒的特异Dig() 标记的探针对PCR 产物进行检测。Dig 标记的cRNA 探针检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度可达1pg/ml 。
2ei硅钢片．5 双链RNA分析(Double-stranded RNA ,dsRNA)
RNA 病毒、类病毒以及卫星RNA 在基因组复制过程中要形成双链的复制型或复制中间体,
因此寄主植物体内存在其dsRNA ,且每一种RNA 病毒、类病毒、卫星RNA 形成的dsRNA 都是特异的,有各自的迁移率、分子量、片段数。但正常的植物组织中无大分子的dsRNA ,因而可以利用dsRNA进行RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测。dsRNA分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。但不适合大量样品的检测,而且需要一定的技术和知识才能准确进行诊断。另外,本方法也不适合DNA 病毒的检测,在负链RNA 病毒如Rhabdovirus 侵染的植物组织中也未发现dsRNA。
3 其它检测方法
3．1 石英晶体微天平生物传感器(Quartz crystal microbalance biosensor)
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