园 艺 学 报 2006,33(2):233～238
Acta Horticulturae Sinica
宗 梅1,2 蔡丽琼1,3 吕素芳1 刘玉潭1 贾书华1 蔡永萍13
(1安徽农业大学生命科学学院，合肥230036;2安庆师范学院生命科学系，安庆246011;3安徽医科大学基础学院，合肥230032)
摘 要：以成熟板栗离体胚轴为材料，通过3种脱水方法，研究了脱水速率对板栗胚轴脱水敏感性及其相关生理的影响。研究结果表明：硅胶脱水(快速脱水)的胚轴脱水敏感性最低，关键含水量最低，胚轴的发芽率与电导率显著负相关，胚轴的生活力与MDA含量显著负相关，对脱水胁迫反应的忍耐力加大，同时抗氧化系统迅速启动。 关键词：板栗；脱水敏感性；顽拗型种子
中图分类号:S66412 文献标识码:A 文章编号:05132353X(2006)022*******
Effect of D i fferen t D esi cca ti on M ethods on C astanea m ollissi m a Em bryo Ax is D esi cca ti on Sen siti v ity and Physi olog i ca l M et abolis m
Zong Mei1,2,Cai L iqi ong1,3,LüSufang1,L iu Yutan1,J ia Shuhua1,and Cai Yongp ing13
(1College of L ife Sciences,A nhui A gricultural U niversity,Hefei230036,China;2D epart m ent of L ife Sciences,A nqing Teachers College,A nqing246011,China;3School of B asic M edical Sciences,A nhui M edical U niversity,Hefei230032,China)
Abstract:The paper studied effects of physi ol ogical metabolis m and desiccati on sensitivity for drying ve2 l ocity on chestnut e mbryo axis thr ough three different drying methods.The results indicated that the desicca2 ti on sensitivity of axis and the critical water content in axis for silica gel drying are l owest.Axis vigour showed negative correlati on with electric conductivity as well as re markable negative correlati on with the content of MDA.Reacti on of axis for stress increased,and anti2oxidative syste m s in axis were triggered rap idly.
Key words:Chestnut;Desiccati on sensitivity;Recalcitrant seed
顽拗型种子(recalcitrant seed)是一类不耐脱水和对低温敏感的种子，目前对其研究主要集中在热带和
亚热带植物上，因温带顽拗型植物种类较少，因而少有报道。板栗是典型的温带顽拗型种子，成熟时仍然保持很高的含水量，其贮藏期间易发生失水、霉烂，丧失生活力。因此，研究板栗种子的脱水敏感性，有助于提高其脱水耐性，进行种质资源长期贮藏。板栗的种子由子叶和胚轴两大部分组成，成熟子叶的含水量明显低于胚轴中的含水量，所以子叶和胚轴对不同的脱水方式表现出不同的脱水速率。作者主要研究了不同脱水方式对成熟板栗离体胚轴生活力、电导率、抗氧化系统及膜脂过氧化的影响，可以为其贮藏保鲜及种质资源保存提供理论指导。 1 材料与方法
111 材料
供试板栗(Castanea m ollissi m a B lu me)品种为‘安徽油栗’。成熟种子于2004年9月底采自安徽肥东县解集乡板栗园，采后立即运回实验室剥离胚轴。
收稿日期:2005-03-18；修回日期:2005-07-21
基金项目：安徽省教育厅自然科学研究项目(2006KJ166B)；安徽省教育厅‘十五’学术带头人基金资助项目(2002)
3通讯作者Author f or corres pondence
园 艺 学 报33卷
112 脱水方式
板栗胚轴的脱水参照伍贤进等〔1〕的方法稍加修改。脱水方式分为:①硅胶脱水(Silica gel dr2 ying,in Si D)，将胚轴置于装有活化硅胶的干燥器中分别脱水1、3、6、12、20h;②氯化钠脱水(NaCl drying,in Na D)，将胚轴置于RH75%(饱和氯化钠溶液)的密闭容器中分别脱水3、6、12、20、30h;③硝酸钾脱水(K NO3drying,in K D)，将胚轴置于RH90%(饱和硝酸钾溶液)的密闭容器中分别脱水5、12、20、30、42h。上述3种方式均在25～28℃室温下进行。
113 测定项目与方法
含水量和胚轴活力的检测：将胚轴放在101～105℃烘箱中杀青10m in,80℃烘干，以鲜样质量为基础计算含水量。将脱水至不同含水量的20个胚轴，分别经70%酒精消毒30s、011%消毒30s，后用无菌水充分漂洗，置于W P M培养基中,25℃培养两周，测定萌发率、胚轴长度。活力指数=萌发率×胚轴平均长度(mm)。
电导率的测定：用DDS211A型电导仪测定，电导率值用μS・c m-1・h-1・g-1F M表示。
超氧化物歧化酶(S OD)和丙二醛(MDA)活性的测定：超氧化物歧化酶以抑制氯化硝基四氮唑蓝(NBT)
光还原50%为酶的活性，用酶活力单位U・h-1・mg-1F M表示；丙二醛采用硫代酸在酸性下加热显，于分光光度计532nm和600nm处测定OD值，以nmol・g-1F M表示〔2〕。
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抗坏血酸过氧化物酶(A s A-P OD)活性的测定：参照邹琦〔3〕的方法稍加修改。3mL反应混合液中含01025mol・L-1磷酸缓冲液(pH710),011mmol・L-1E DT A,015mmol・L-1A s A,1mmol・L-1H2O2和013mL酶液。加入后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，以每m in OD下降0101为1个酶活性单位。
过氧化氢酶(CAT)活性的测定:3mL反应混合液中含115mL012mol・L-1磷酸缓冲液(pH 718),013mL1mmol・L-1H2O2,012mL酶液,1mL蒸馏水,240n m下测定吸光度，以每m in内A240减少0101的酶量为1个酶活性单位。
脂氧合酶(LOX)含量的测定：参照陈昆松等〔4〕的方法加以修改。反应液组成:011mL T ween2 20分散于10mL012mol・L-1硼酸缓冲液中(pH910)，加入011mL亚油酸充分混匀，再加入013 mL110mol・L-1Na OH，充分震荡，将pH调至612，稀释并定容至200mL。反应体系中含反应液015mL，缓冲液214mL，酶液011mL，反应温度30℃，于234n m处测定LOX活性，记录4m in内OD值变化，以每m in OD变化0101为1个酶活性单位。
过氧化物酶(P OD)活性的测定：反应混合液为012mol・L-1磷酸缓冲液(pH610)50mL，过氧化氢0102
8mL，愈创木酚01019mL。取1mL酶液，再加入3mL反应混合液，于波长470nm下测量反应5m in时的光密度值，以每m in OD减少0101为1个酶活性单位。
以上测定项目，各处理每次至少作3次重复。
2 结果与分析
211 不同脱水方式对板栗胚轴含水量、发芽率和
活力指数的影响
成熟板栗种子胚轴在未脱水时，含水量高达64%。通过以上3种方式对离体胚轴进行脱水，含水量均有不同程度的下降(表1)，硅胶、NaCl 和K NO
3
方式的脱水速率分别为2164、1105、0193g・h-1・g-1F M，硅胶脱水最快,NaCl次
之,K NO
3
最慢。
板栗离体胚轴对脱水很敏感，在3种脱水方
表1 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下含水量的变化Table1 Changes of m o isture con ten ts i n chest nut e m bryo ax is a t
three dry i n g m ethods(%)
脱水时间
D rying ti m e(h)
脱水方式D rying method
硅胶Silica gel NaCl K NO3
064100±010864100±010864100±0108 162109±0105--
353169±011260115±0103-
5--55141±0111 650179±010553144±0108-
1236139±010950166±011148113±0110 2011190±010341120±010740124±0112
30-31186±010935173±0104
42--21103±0108
432
2期宗 梅等：不同脱水方法对板栗胚轴脱水敏感性和生理生化的影响 式下，随着水分的丧失，胚轴发芽率和活力指数均迅速下降(图1)。整个脱水处理过程中，硅胶脱水的胚轴发芽率和活力指数均较高于NaCl 和K NO 3脱水的胚轴。在脱水初期，硅胶脱水的胚轴发芽率和活力指数下降缓慢，而后两者则下降较快。3种脱水方式下引起的胚轴半致死含水量不同，分别为34178%、45175%、37129%
。
图1 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下发芽率和活力指数的变化
F i g .1 Changes of germ i n a ti on percen t age and v i gour i n dex of exc ised em bryo ax is i n ma ture chest nut a t three dry i n g m ethods 212 不同脱水方式对板栗胚轴电导率的影响
板栗离体胚轴随着脱水程度的增加，其浸泡液电导率逐渐增加(图2)。在脱水初期,3种脱
水方式下的电导率增加缓慢，当硅胶、NaCl 和
K NO 3脱水的成熟板栗离体胚轴含水量分别降至
36139%、50166%、40124%时，电导率开始迅速
增加，说明细胞膜完整性受到严重损伤。同时,
硅胶脱水的电导率低于NaCl 和K NO 3脱水的电导
静态管理率，硅胶脱水和NaCl 脱水的电导率与其发芽率的
相关系数分别达到r 硅胶，发芽=-0197003和r N aC l，发芽
=-0191953，表现为显著负相关，其余的相关不显著。
图2 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下电导率的变化F i g .2 Change of electrolye conducti v ity of exc ised e m bryo ax is
i n ma ture chest nut a t three dry i n g m ethods 图3 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下MDA 含量和LO X 活性的变化
F i g .3 Change of MDA con ten ts and LO X acti v iti es of exc ised em bryo ax is i n ma ture chest nut a t three dry i n g m ethods 213 不同脱水方式对板栗胚轴MDA 和LO X 的影响
3种脱水方式下，它们的MDA 含量随着脱水程度的加剧而逐渐上升(图3),K NO 3脱水的胚轴中MDA 含量低于另两种脱水方式。3种方式脱水的MDA 含量与其自身的发芽率和活力指数的相关系数分别达到r 硅胶，发芽=-018500、r 硅胶，活力=-0191443;r N aC l，发芽=-0197033、r N aC l，活力=-0199023
;r K NO 3，发芽=-0198773、r K NO 3，活力=-0190563，说明MDA 与种子活力呈显著负相关，且在三者的半致死含水量为34178%、45175%、37129%时，它们的MDA 含量分别为8715244、8010794、7915210
532
n mol ・g -1F M 。板栗胚轴LOX 活性表现出不同的变化趋势，基本上随着水分的丧失,LOX 活性表现先略下降，再上升，最后再下降的趋势。
214 不同脱水方式对板栗胚轴S OD 和CAT 活性的影响
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在3种方式脱水过程中,S OD 、CAT 活性基本表现先稍下降，后上升，再迅速回落的趋势(图4)。硅胶脱水的胚轴当含水量降至36139%时,S OD 和CAT 依然保持较高水平;NaCl 脱水的胚轴在含水量降至50166%时,S OD 和CAT 活性出现峰值，且S OD 活性明显低于另两种脱水方式;K NO 3脱水的胚轴S OD 和CAT 活性表现上升、下降的趋势，当其含水量为40124%时,CAT 和S OD 活性均处于较高水平。
图4 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下S OD 和CAT 活性的变化
F i g .4 Changes of S OD and CAT of exc ised e m bryo ax is i n ma ture chest nut a t three dry i n g m ethods
215 不同脱水方式对板栗胚轴A s A -POD 的影响
3种脱水方式下的P OD 活性，基本表现为先缓慢上升，后升至高峰值，再明显降低的趋势(图5)，三者P OD 活性峰值出现的含水量不同。硅胶脱水的胚轴当含水量为36139%时,A s A -P OD 活性较高;NaCl 脱水的胚轴在含水量为50166%时,A s A -P OD 活性出现峰值;K NO 3脱水的胚轴中A s A -P OD 活性明显低于前两种脱水方式，当含水量为35173%时,A s A -P OD 活性最高。
图5 成熟板栗离体胚轴在3种脱水方式下P OD 和A s A -POD 活性的变化
F i g .5 Changes of POD and A s A -POD of exc ised em bryo ax is i n ma ture chest nut a t three dry i n g m ethods
3 讨论与结论
311 脱水速率对植物脱水耐性的影响研究报道较多。B lack man 等〔5〕、Etienne 等〔6〕和L i 等〔7〕研究报道，慢速脱水能够显著地增加正常型种子成熟胚和未成熟胚或者种子的脱水耐性。因慢速脱水被认为
允许植物组织在延长的缓慢脱水期间，有足够的时间获得脱水耐性。相反,Farrant 等〔8〕和Pa mmenter
等〔9〕研究发现，对于许多顽拗型种子和胚，慢速脱水对它们的脱水耐性是有害的。最近,L iang 等〔10〕研究报道，对于植物组织达到它的最大脱水耐性，实际上有一个最佳的脱水速率，因此脱水速率表现
出显著地修饰植物组织忍受脱水胁迫的能力。成熟板栗胚轴通过硅胶、NaCl和K NO
脱水，即快速
3
中速、慢速脱水，其发芽率和活力指数均明显下降，硅胶脱水的发芽率和活力指数表现最高，因此快速脱水的成熟板栗离体胚轴脱水耐性最高。同时硅胶脱水的半致死含水量最低，与Berjak等〔11〕对拉独费藤(L andolphia kirkii)，伍贤进等〔1〕对黄皮(C lausena lansium)的离体胚轴的研究结果类似。Berjak等〔12〕曾提出，离体胚轴的迅速干燥能减少在中间含水量下脱水胁迫反应发生的时间。因此，硅胶脱水的板栗胚轴，表现出脱水敏感性最低，可能是因为胚轴处于中间含水量的时间较短，脱水胁迫反应发生较少的原因。
312 脱水对组织的伤害，主要表现为质膜或细胞器膜结构和功能的破坏，引起电解质大量外渗。W ang等〔13〕提出，利用电导率的方式来确定脱水耐性的关键含水量，且脱水速率影响关键含水量。在3种脱水方式下，随着脱水的进行，电导率均表现出先稍有上升，再迅速上升的趋势，从而得出硅胶、NaCl和K NO
脱水的成熟板栗离体胚轴关键含水量分别为36139%、50166%、40124%，硅胶脱
3
水的关键含水量最低。
313 MDA是膜脂过氧化的最后产物，细胞膜脂过氧化作用的启动需要LOX的参与，二者均是膜脂过
无感电阻器氧化的指标。3种脱水方式下的胚轴MDA含量均随着水分的丧失而增加，与种子活力的相关系数均达到r=-019以上，呈现显著负相关，与脱水耐性也呈显著负相关；当3种脱水方式下胚轴中MDA含量在80n mol・g-1F M左右时，板栗种子的生活力降为一半，且硅胶脱水的胚轴MDA含量高于另两种脱水方式，可能是硅胶脱水的胚轴对伤害的忍受力加大，这有待更进一步的研究。3种脱水方式下LOX活性先高后低，可能是LOX在启动膜脂过氧化后，即发生了自我毁坏的结果，具体反应，还有待进一步的研究。
314 Mc Donald等〔14〕研究表明，抗氧化系统活性的下降以及膜脂过氧化作用的加强是种子劣变的主要原因。L i等〔15〕研究发现，顽拗型种子可可的胚轴脱水敏感性与抗氧化酶活性的下降相关。S OD、CAT、P OD、A s A-P OD活性的高低直接影响着脱水耐性，且它们共同协作，避免在脱水期间活性氧积累造成氧化伤害〔16〕。硅胶脱水的胚轴S OD、CAT活性从脱水初期到关键含水量时，一直处于较高水平，可能是快速脱水信号迅速刺激了S OD、CAT的表达，使其活性一直较高。之后随着水分丧失日益严重，膜脂过氧化作用加强,S OD、CAT迅速下降；在脱水初期，硅胶脱水的胚轴P OD、A s A-P OD表现出较高活性，后迅速下降。当降至关键含水量时，又再次达到峰值，可能是P OD、A s A-P OD对快速脱水信号反应表现滞后，也可能是因为与S OD、CAT活性互补，共同协作的原因。
就本试验研究结果来看，在不同脱水方式下，硅胶脱水(快速脱水)胚轴的关键含水量最低，板栗胚轴
脱水敏感性最低，部分原因是缩短了胚轴处于中间含水量的时间，减少脱水胁迫反应有害物质的累积，并快速启动了抗氧化系统的结果。而NaCl脱水(中速脱水)胚轴脱水敏感性表现最高，表明成熟板栗离体胚轴的脱水，需超过一定的速率。因此，对于板栗的贮藏保鲜和种质资源保存，可以先采取迅速脱水的方式，对其进行贮藏预处理，再进行超低温保存。这有待于进一步研究。
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