一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器及其制备方法

1.本发明属于荧光传感器技术领域，具体涉及一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器及其制备方法，该传感器可以实现体外谷胱甘肽的定量检测以及细胞内谷胱甘肽的监测。

背景技术：

2.谷胱甘肽是生物和真核细胞内的一种内源性抗氧化剂，与生物体内抗氧化防御系统、细胞生长调节和蛋白质功能等多种生理功能密切相关。谷胱甘肽水平异常与癌症、心脏病或白细胞减少等疾病密切相关。因此，开发敏感、可靠的实时监测谷胱甘肽水平的技术至关重要。
3.目前已开发出一系列检测谷胱甘肽的方法，如电化学法、比法、质谱法、荧光法等。其中，荧光法具有灵敏度高、操作简单、分析实时等优点。传统的检测谷胱甘肽的荧光法通常基于硫醇敏感的有机荧光团，尽管它们有一定的优点，但由于光漂白，它们不适合长期检测，而且紫外/可见光激发引起的生物自发荧光严重限制了检测灵敏度。
4.作为一种替代材料，稀土掺杂上转换纳米颗粒由于其近红外激发、优良的光稳定性、较深的组织穿透深度以及无生物自荧光等优点在生物传感应用方面具有独特的优势。在上转换纳米颗粒用于谷胱甘肽检测的报道中，稀土掺杂的上转换纳米颗粒作为能量供体首先被近红外激发，然后无辐射地将激发能量转移到附近的光谱匹配受体导致上转换发光猝灭，这种受体诱导的发光猝灭可以通过加入谷胱甘肽来恢复，从而可以对谷胱甘肽进行监测。虽然基于上转换纳米颗粒的谷胱甘肽检测技术克服了传统方法的许多缺点，但离临床实际应用还很远，主要是由于以下两个不可克服的问题，这也是基于上转换-发光共振能量转移的免疫检测技术普遍存在的问题:(1)施主有限的上转换发光利用不足。常用的敏化剂yb
3+
和激活剂er
3+
共掺上转换纳米颗粒，由于其固有的发射特性，荧光效率较低。上转换纳米颗粒作为施主，由多个发光中心组成，由于发光共振能量转移效率与施主与受主之间的距离成反比，只有位于界面的外部发光中心(er
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)与受体足够近才能产生有效的发光共振能量转移，而粒子内部距离受体稍远的发光中心(er
3+
)对发光共振能量转移没有贡献，从而显著降低了发光共振能量转移效率，限制了检测灵敏度。(2)供体-受体复合体稳定性差。现有的谷胱甘肽检测技术的供体-受体结合主要依靠静电吸附，在复杂的生物环境中稳定性差，受体容易与供体分离，不利于实际应用。因此，迫切需要探索新的设计思路和方法，构建一种能量传递效率高、稳定性好的上转换-发光共振能量转移免疫分析技术。

技术实现要素：

5.一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器及其制备方法。本发明旨在利用lierf4基上转换纳米粒子的自敏化特性以及在zif-8表面原位生长mno2纳米粒子的供体-受体组装方法来提高检测的灵敏度，该传感器可以实现体外谷
胱甘肽的定量检测以及细胞内谷胱甘肽的监测。
6.本发明利用金属簇与有机配体配位自组装将zif-8包覆在lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子表面，并利用高锰酸钾与zif-8中甲基的氧化还原反应在zif-8表面原位生长mno2纳米粒子。mno2纳米粒子可以猝灭上转换荧光，再通过谷胱甘肽消耗mno2使荧光恢复来检测谷胱甘肽。lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4纳米粒子由于其自敏化特性可以提高荧光共振能量转移效率，而mno2在zif-8表面的原位生长可以提高供体-受体复合物的稳定性，二者均可提高检测谷胱甘肽的灵敏度，同时利用lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4的多波长激发特点选择了生物损伤小的808nm激发光实现了细胞内的谷胱甘肽监测，该传感器能够针对癌细胞中的高谷胱甘肽含量实现癌细胞与正常细胞的区分。
7.本发明所述的一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器的制备方法，其步骤如下：
8.(1)核壳结构的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子的合成(lierf
4-oa)：利用溶剂热法制备lierf4:0.5％tm
3+
裸核上转换纳米粒子，然后在lierf4:0.5％tm
3+
裸核上外延生长liyf4惰性壳层，得到亲油性的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子，最后将核壳上转换纳米粒子分散到环己烷溶液中；
9.(2)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子的制备(lierf
4-pvp)：先用盐酸去配体法将步骤(1)制备的亲油性的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子表面的油酸配体去除，得到亲水性的无配体上转换纳米粒子，然后将pvp配体修饰在无配体上转换纳米粒子表面，得到的pvp修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子(lierf
4-pvp)，然后分散到甲醇中；
10.(3)lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4@zif-8的制备(lierf4@zif)：利用金属簇与有机配体自组装的方法在lierf
4-pvp表面包覆zif-8外壳，将得到的lierf4@zif分散在甲醇溶液中；
11.(4)修饰mno2的lierf4@zif纳米复合材料的合成(lierf4@zif-mno2)：利用zif-8中甲基与kmno4之间的氧化还原反应在lierf4@zif表面原位生长mno2纳米粒子，得到lierf4@zif-mno2纳米复合材料，然后分散在水溶液中；
12.(5)向步骤(4)的lierf4@zif-mno2纳米复合材料水溶液中加入已知不同浓度的谷胱甘肽水溶液，制成1ml的待测溶液；将待测溶液在室温下反应10min，然后测定待测溶液的上转换发射光谱；建立谷胱甘肽浓度与上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)的关系曲线，从而制备得到本发明所述的基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器；
13.(6)向步骤(4)的lierf4@zif-mno2纳米复合材料水溶液中加入未知浓度的谷胱甘肽水溶液，得到1ml的待测溶液；将待测溶液在室温下反应10min，然后测定待测溶液的上转换发射光谱；将上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)的数值代入步骤(5)得到的关系曲线，从而计算得到谷胱甘肽的浓度。
14.工作原理：
15.本发明利用mno2纳米粒子猝灭lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4在808nm激发光激发下产生的强的近单红光，谷胱甘肽会消耗mno2使荧光恢复，根据红光强度变化与谷胱甘肽浓度的线性关系来定量检测谷胱甘肽。
16.本发明制备的基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传
感器lierf4@zif-mno2具有以下优点：
17.1.lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4是一种自敏化(er
3+
同时作为敏化剂和活化剂)能级强相关上转换纳米材料，能量激发、迁移、转移和发射过程集中在er
3+
离子之间。基于这种典型的能量迁移效应，内外发光中心(er
3+
)均可通过能量迁移向受体贡献能量，突破发光共振能量转移中距离的限制，实现施主发光的充分利用，提高发光共振能量转移效率。
18.2.由于lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4中er
3+
离子具有丰富的阶梯状能级，在多种激光(800nm、980nm、1530nm)的激发下均能产生近单的红光发射，能够拓宽激发光源，有益于谷胱甘肽检测的广泛应用。
19.3.测试采用的808nm激发光，能够避免通常使用的980nm激发产生的热效应对生物造成损伤，有利于提高细胞实验的准确性。
20.4.引入了沸石型咪唑框架-8(zif-8)作为lierf4供体和受体的结合桥梁。zif-8表面的甲基配体(-ch3)可以被kmno4氧化生成mno2纳米颗粒，在zif-8表面原位生长，增加了mno2纳米颗粒负载的稳固性，从而保证了发光共振能量转移效率。与以往广泛应用的受体mno2纳米片相比，mno2纳米粒子尺寸更小，比表面积更大，与谷胱甘肽反应更充分，可以有效提高检测的灵敏度。
附图说明
21.图1：本发明所述的基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器的制备过程及其在细胞中的应用示意图。首先制备了lierf4:0.5％tm
3+
裸核上转换纳米粒子，为了提高其发光性能在其表面包覆了liyf4惰性外壳，形成亲油性的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子，然后利用聚乙烯吡咯烷酮对其进行表面修饰，将其转变为亲水性的上转换纳米粒子，接下来利用金属簇与有机配体自组装的方法在其表面包覆zif-8外壳，最后利用高锰酸钾与zif-8中甲基之间的反应使mno2原位生长在zif-8表面，形成最终的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4@zif-mno2(lierf4@zif-mno2)纳米复合材料。mno2作为能量受体可以有效猝灭上转换荧光，而谷胱甘肽对mno2的刻蚀可以使上转换荧光恢复，这样就可以建立谷胱甘肽与上转换荧光之间的关系来进行谷胱甘肽的检测。癌细胞由于缺乏对谷胱甘肽的调控导致癌细胞中谷胱甘肽的含量要远高于正常细胞，因此，制备的lierf4@zif-mno2纳米复合材料在癌细胞中的上转换荧光强度要远高于在正常细胞中的荧光强度，可以实现对癌细胞以及正常细胞的区分。
22.图2：检测例1中谷胱甘肽传感器lierf4@zif-mno2在808nm激光激发下上转换发光随谷胱甘肽浓度变化曲线。
23.图3：检测例1中谷胱甘肽传感器lierf4@zif-mno2在808nm激光激发下上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)与谷胱甘肽浓度的线性关系图，其中f为体系中加谷胱甘肽后的上转换红光发射积分强度，f0为体系不加谷胱甘肽的上转换红光发射积分强度。
24.图4：检测例2的干扰检测结果统计图。
25.图5：检测例3的细胞内监测谷胱甘肽的实验结果图，其中图5a为hepg2细胞，图5b为nmm处理过的hepg2细胞，图5c为hela细胞，图5d为nmm处理过的hela细胞，图5e为ht22细胞，图5f为nmm处理过的ht22细胞。
具体实施方式
26.实施例1：lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子的合成(lierf
4-oa)
27.以下实施例中，lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子通过参考文献(li,z.,zhang,y.,nanotechnology,2008.19,345606)中记载的高温溶剂热法制备而得。
28.(1)首先将tmcl3·
6h2o(0.005mmol)、ercl3·
6h2o(0.995mmol)、14ml十八烯(ode)和6ml油酸(oa)在50ml烧瓶中混合并搅拌30分钟；将上述溶液升温到150℃，持续40分钟，再冷却到50℃；加入10ml含有lioh(2.500mmol)和nh4f(4.000mmol)的甲醇溶液，并加热至70℃反应30分钟。然后将混合物升温到305℃，持续90分钟，并冷却到50℃，用丙酮和乙醇离心后得到平均尺寸为(29.5
±
1.0)*(18
±
0.8)nm的lierf4:0.5％tm
3+
裸核上转换纳米粒子(tm
3+
的摩尔掺杂量为tm
3+
和er
3+
摩尔量之和的5％)。最后，将得到的裸核上转换纳米粒子溶解在8ml的环己烷中待用(裸核上转换纳米粒子的浓度为125mm)。在整个实验过程中，保证氮气流通以去除反应体系中的氧气。
29.(2)将ycl3·
6h2o(0.750mmol)、10ml ode和5ml oa的混合物在50ml烧瓶中混合并搅拌30分钟。将上述溶液升温至150℃，持续40分钟，然后冷却至50℃。再加入4ml步骤(1)制备的lierf4:0.5％tm
3+
裸核的环己烷溶液，并升温到85℃反应30分钟，然后冷却到50℃。加入5ml含有lioh(1.875mmol)和nh4f(3.000mmol)的甲醇溶液，并加热到70℃，持续30分钟。再将溶液升温至305℃，持续70分钟，然后冷却至50℃，用丙酮和乙醇洗涤离心后得到亲油性的平均尺寸为(41.6
±
1.7)*(25.2
±
1.4)nm的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子(lierf
4-oa)；最后，将得到的核壳结构上转换纳米粒子溶解在4ml的环己烷中待用(核壳结构上转换纳米粒子的浓度为125mm)。在整个实验过程中，保证氮气流通以去除反应体系中的氧气。
30.实施例2：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子的制备(lierf
4-pvp)
31.(1)首先将2ml分散有0.25mmol lierf
4-oa的环己烷溶液加入到2ml(0.1m)稀盐酸溶液中，搅拌12h以去除油酸配体；再加入丙酮沉淀无配体lierf4纳米颗粒，离心收集无配体lierf4纳米颗粒，分散在2ml乙醇中，得到分散有无配体lierf4纳米颗粒的乙醇溶液(浓度为125mm)；
32.(2)然后将1ml分散有无配体lierf4纳米颗粒的乙醇溶液与5ml含pvp(0.3g,mw＝40000)的乙醇溶液混合，在室温下搅拌24h；将得到的lierf
4-pvp纳米颗粒用适量的正己烷沉淀，离心收集lierf
4-pvp纳米颗粒，用乙醇洗涤，然后分散在1ml甲醇中，得到lierf
4-pvp的甲醇溶液(浓度为125mm)。
33.实施例3：lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4@zif-8的制备(lierf4@zif)
34.(1)将1ml分散有lierf
4-pvp的甲醇溶液与5ml含zn(no3)2·
6h2o的甲醇溶液(25mm)混合，搅拌30分钟，然后加入5ml含2-甲基咪唑的甲醇溶液(25mm)。混合物在40℃下静置反应24小时，得到的lierf4@zif产物通过离心收集，用甲醇洗涤三次以除去未反应的离子，然后分散在2ml水中，得到lierf4@zif水溶液(浓度为62.5mm)。
35.实施例4：修饰mno2的lierf4@zif纳米复合材料的合成(lierf4@zif-mno2)
36.将2ml kmno4(1mg/ml)水溶液和2ml lierf4@zif水溶液混合，在冰浴中搅拌30分钟，直到溶液变为棕。离心收集产物，用去离子水洗涤，最终产物分散在2ml水中，得到修
饰mno2的lierf4@zif纳米复合材料水溶液(浓度为62.5mm)。
37.检测例1：lierf4@zif-mno2纳米复合材料在水溶液中对谷胱甘肽的检测
38.向lierf4@zif-mno2纳米复合材料水溶液中加入不同浓度的谷胱甘肽溶液，制成一系列1ml的待测溶液(最终制成的待测溶液中，lierf4@zif-mno2纳米复合材料的浓度为6.25mm，谷胱甘肽的浓度分别为0，1，2，4，5，7，9，20，30，40，50，60，80，100，200，300，400μm)，将得到的混合物在室温下反应10min，然后用型号为quant master 8000的荧光光谱仪测定待测溶液的上转换发射光谱。结果见图2，随着谷胱甘肽浓度的增加，红光强度(640～680nm)逐渐恢复。同时谷胱甘肽浓度与上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)在0～9μm和9～100μm之间具有较好的线性关系，分别满足(f-f0)/f0＝0.18978c+0.25011和(f-f0)/f0＝0.02779c+1.73023方程(其中f为体系中加入谷胱甘肽后的上转换红光发射积分强度，f0为体系不加入谷胱甘肽的上转换红光发射积分强度3、单位为μm，积分的波长范围为640～680nm)，如图3所示。
39.检测例2：lierf4@zif-mno2纳米复合材料对谷胱甘肽含量的特异性检测
40.向lierf4@zif-mno2纳米复合材料的水溶液中分别加入的硫酸钠、氯化钠、氯化锌、氯化镁、碳酸钾、氯化锰、氯化铜、氯化钾、氯化钡、硫酸镁、葡萄糖、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸以及谷胱甘肽的水溶液制成1ml的待测溶液进行特异性检测(待测溶液中纳米复合材料的浓度为6.25mm，其他待测物质的浓度均为400μm)，测试结果如图4。从图中可以看出，加入谷胱甘肽样品的红光上转换荧光增强比远高于加入其它物质的样品，而半胱氨酸由于含有硫醇，同样表现出了一定程度的上转换荧光恢复，但是由于谷胱甘肽在细胞中的含量要远高于半胱氨酸，所以半胱氨酸对上转换荧光恢复的影响可以忽略不计。
41.检测例3：lierf4@zif-mno2纳米复合材料用于细胞内谷胱甘肽的监测
42.将hepg2细胞、hela细胞和ht22细胞以70％的密度在35mm玻璃底培养皿中培养24小时。加入合适量的纳米复合材料(50μg/ml)的培养液，孵育3h。用hbss洗涤5次后进行荧光成像。对照组细胞为降低细胞内gsh含量，在加入纳米复合物前，用2ml含有nmm(nmm为n-甲基马来酰亚胺，一种谷胱甘肽清除剂，浓度为500μm)的培养液孵育30min进行预处理，然后用hbss洗涤细胞三次后再加入纳米复合材料进行孵育，细胞成像结果如图5所示，可以看出hepg2细胞(图5a)和hela细胞(图5c)由于其细胞内的高谷胱甘肽含量从而显示出明显的上转换红光，而ht22细胞(图5e)基本观察不到红光发射；而在对照组细胞中，由于提前用nmm对细胞进行了预处理，所以导致hepg2细胞(图5b)、hela细胞(图5d)和ht22细胞(图5f)的上转换红光发射强度明显降低。

技术特征：

1.一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器的制备方法，其步骤如下：(1)核壳结构的lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的合成：利用溶剂热法制备lierf4:0.5％tm
3+
裸核上转换纳米粒子，然后在lierf4:0.5％tm
3+
裸核上外延生长liyf4惰性壳层，得到亲油性的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子，最后将核壳上转换纳米粒子分散到环己烷溶液中；(2)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子的制备：先用盐酸去配体法将步骤(1)制备的亲油性的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4核壳结构上转换纳米粒子表面的油酸配体去除，得到亲水性的无配体上转换纳米粒子，然后将pvp配体修饰在无配体上转换纳米粒子表面，得到的pvp修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子，然后分散到甲醇中；(3)lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4@zif-8的制备：利用金属簇与有机配体自组装的方法在步骤(2)制备的pvp修饰的lierf4:0.5％tm
3+
@liyf4上转换纳米粒子表面包覆zif-8外壳，将得到的lierf4@zif分散在甲醇溶液中；(4)修饰mno2的lierf4@zif纳米复合材料的合成：利用zif-8中甲基与kmno4之间的氧化还原反应在lierf4@zif表面原位生长mno2纳米粒子，得到lierf4@zif-mno2纳米复合材料，然后分散在水溶液中；(5)向步骤(4)的lierf4@zif-mno2纳米复合材料水溶液中加入已知不同浓度的谷胱甘肽水溶液，制成1ml的待测溶液；将待测溶液在室温下反应10min，然后测定待测溶液的上转换发射光谱；建立“谷胱甘肽浓度与上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)的关系曲线”，从而制备得到所述的基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器；f为体系中加入谷胱甘肽后的上转换红光发射积分强度，f0为体系不加入谷胱甘肽的上转换红光发射积分强度；c为谷胱甘肽浓度，单位为μm，积分的波长范围为640～680nm。2.一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器，其特征在于：是由权利要求1所述的方法制备得到。3.如权利要求2所述的一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器，其特征在于：向lierf4@zif-mno2纳米复合材料水溶液中加入未知浓度的谷胱甘肽水溶液，得到1ml的待测溶液；将待测溶液在室温下反应10min，然后测定待测溶液的上转换发射光谱；将上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)的数值代入“谷胱甘肽浓度与上转换发光荧光增强比((f-f0)/f0)的关系曲线”，从而计算得到谷胱甘肽的浓度。

技术总结

一种基于能级强相关上转换纳米探针的高选择性、高灵敏度谷胱甘肽传感器及其制备方法，属于荧光传感器技术领域。本发明首先制备LiErF4:0.5％Tm

技术研发人员：

卢革宇 刘晓敏 卢扬

受保护的技术使用者：

吉林大学

技术研发日：

2022.07.05

技术公布日：

2022/10/13