立式升降机摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。 关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选
Breeding of high-yielding lysine producers
Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here,
we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones.
Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening
气动真空阀L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
一个合适的赖氨酸高产菌株应该具备以下几点：能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
在菌种选育中，若采用传统的诱变育种或杂交育种[1,2]，由于基因突变为随机突变，必将消耗大量的人力物力进行筛选；原生质体融合技术可以使一些未发现有转化、转导和结合等现象的原核生物之间，以及微生物不同种、属、科甚至更远缘的微生物细胞进行融合，得到新物种。但是原生质体融合
保温玻璃膜难度较大，并非每次都能够成功[3]。
目前菌种选择的总趋势是由自然选育向代谢控制育种，诱发基因突变向基因重组的定向育种转变。基因工程育种包括所有的利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得某些优良性状或利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于大肠杆菌是单细胞，结构简单，生长速度快，培养简单，遗传背景清楚等优点，所以比较容易进行基因工程改造。
1、菌种改造
由于细胞内的代谢不是一个孤立的过程，而是一个相互联系的网络，网络之间会相互制约，因此目前在对菌株进行基因改造时，往往不是仅仅对某个基因进行单独的改造，而是对目的产物形成过程中一系列相关基因进行改造。如基因的过量表达、提高基因表达产物的活性、降低基因拷贝数、降低基因表达产物的活性等等措施。增加细胞膜的通透性、增强目的产物向胞外的运输、降低支路代谢的代谢流、弱化关键酶对终产物反馈抑制的敏感度等都有助于目的产物的积累。因此为了提高赖氨酸产量，增加工程菌菌株的稳定性，一般要做到以下几点中的一点或几点。
1.1过量表达赖氨酸合成相关基因
菌株细胞内过量表达赖氨酸合成相关酶基因，可以增加赖氨酸合成代谢流，直接增加赖氨酸的积累。
菌株过量表达的基因：dapA基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）、dapB基因（二氢吡啶二羧酸还原酶基因）、dapE基因（琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶基因）、lysC基因（天冬氨酸激酶基因）、lysE基因（赖氨酸输送蛋白基因）、pyc基因（丙酮酸羧化酶基因）、gap基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）基因中的一个或多个。通过增加pyc基因和lysE基因的拷贝数和改变dapA基因的启动子来实现基因的超量表达[4-7]。同时资料还显示：对于给定的pyc基因，dapA、dapB及lysC基因同时也过量表达对赖氨酸生产格外有利[4]。
1.2降低支路代谢流
过量表达赖氨酸合成途径中的关键基因会增加赖氨酸的表达量。同时资料还显示：降低
iccn
支路代谢相关酶的表达量或活性或敲除支路代谢相关基因构建营养缺陷性同样会增加赖氨酸的表达量[7,8]。降低糖异生代谢途径流量，利用一个弱的启动子或编码相应的具有低活性的酶的基因或等位基因来实现pck基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）、pgi基因（葡萄糖-6-磷酸异构酶）的弱化[7]。降低由天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的量，继而蛋氨酸、苏氨酸的合成量也会降低，生成的Thr的量不足以与Lys共同对天冬氨酸激酶(AK)起协同反馈抑制作用[8]（在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。Ｌ-赖氨酸和Ｌ-苏氨酸对天冬氨酸激酶有协同反馈抑制作用）都有助于赖氨酸的积累。
图1.大肠杆菌赖氨酸合成途径
1.3解除抑制作用
为了解除赖氨酸和/或苏氨酸对dapA基因和lysC基因的反馈抑制作用，在将dapA基因和lysC基因导入菌株之前，常常将二者进行人工的修改，改变基因的编码序列，使两者编码的蛋白对赖氨酸的反馈抑制作用脱敏[6,9-11]。
在生产中用到的基因突变体及其编码的蛋白质突变位点如下：棒状杆菌lysC基因编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶[10]，蛋白突变位点为A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I，S381F中的一个或多个。大肠杆菌lysC基因Ⅲ(天冬氨酸激酶基因Ⅲ)
为对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变体[6]，其突变位点为:D323G，D323G/D408G，C34R/D323G，F325L，I318M，I318M/M349V，L345S，M347V，I352T，I352T/F369S，K164E，I417M/Y419C。来自大肠杆菌的dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)突变体[6,11]，使二氢吡啶二羧酸合酶对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏：V81A，Y118H，V81A/Y118H。
1.4改善细胞膜的通透性
改善细胞膜的透过机能，如在细胞内过量表达lysE基因(赖氨酸输送蛋白基因)有助于微生物胞内合成的赖氨酸向胞外运输，降低胞内赖氨酸含量[6]，进一步减弱Ｌ-赖氨酸和Ｌ-苏氨酸对赖氨酸合成的协同反馈抑制作用，增加赖氨酸的产量，同时有利于产品的后续加工。
1.5整合基因
节能转轮除湿机
通过附加型质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因，其缺点为发酵期间所述质粒可能会丧失，同时需要添加外源的抗生素来维持选择压力。若将赖氨酸合成相关基因整合到大肠杆菌基因组中，使大肠杆菌中除天然位点含有编码L-赖氨酸合成相关蛋白的基因至少一个拷贝外，还在其他任选位点含有整合进染体的这种开放阅读框、基因或等位基因的第二个、第三个或第四个拷贝。这样外源基因就不会在大肠杆菌的复制过程中丢失，同时也不需要添加外源的抗生素来维持选择压力[12]。
由上述多个菌种的改造和筛选过程可以看出，随着时间的推移，在对微生物进行基因改造时，越来越多的是从微生物的整体代谢来考虑，而不是仅仅去增强或减弱某一个基因，这主要是因为细胞的生化反应是一个网络整体，不是独立的，不应孤立地来考虑。目前主要是利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，用以实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物。
2、菌种筛选
在上述的不管是对菌株进行基因工程的改造，还是通过紫外线、化学诱变剂进行诱变育种，还是对新菌株进行培养基优化都无法绕开大量繁琐的筛选工作，他们都需要进行大量的摇瓶实验。但是摇瓶实验筛选工作量大，周期长和成本高，难以达到工业化生产的要求，因此应寻一种能够开展多参数的、与发酵工艺过程相结合的高通量菌种筛选技术和方法。
目前高通量筛选能够实现多参数在线检测功能，可同时测量pH值、DO、Pco2、OD等重要参数；在一台微反应器上集成的微发酵罐数可达6、1224、4896个不等，能够实现高通量分析功能；同时整个筛选的体积小，其体积一般小于100 mL，有的甚至小至5 μL。此外，还有造价低、减少昂贵原材料消耗、降低劳动强度等优势[13]。
目前高通量筛选技术依然在改进，同时也越来越多的应用于高产菌株的筛选过程中，多
篇报道也验证了高通量筛选在高产菌株筛选中的可行性[14-17]，建立了各种高产菌株高通量筛选方法，取得了一定的成果，为高产菌株的筛选节省了大量的人力物力财力，一步一步向工业化生产的要求靠近。
3、结语
虽然采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但是微生物的自发突变和诱发突变都是随机的，因此不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术尤其是的DNA重组技术的发展，使人们能够在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状，达到定向改良菌种的目的。目前日本味之素、德国德古萨等公司已经将分子育种运用到生产中，并表现出明显的优势。定向的菌种改良结合高通量的菌种筛选方法，极大的改变了传统的菌种选育方式，节约了人力物力，缩短了筛选周
期，使菌种选育变得更加高效便捷。
参考文献
[1]齐秀兰，曾绍钧，周忠喜. L-赖氨酸高产菌株的选育及发酵培养基优化[J]. 沈阳药科大学学报.2004, 21(4):311-314.
[2]陈银芳，张伟国. L-赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化[J]. 生物技术.2009, 19(4):36-40.
局部镀锡
[3]施巧琴，吴松刚. 工业微生物育种学[M].北京：科学出版社,2006.
[4]卡洛琳·克罗伊策贝蒂娜·默克尔，·普费弗勒等.生产L-赖氨酸的棒杆菌和制备赖氨酸的方法[P].中国专利:ZL00120357.6, 2000-07-07.
[5]M·M·古斯雅蒂娜,Y·I·科兹洛夫,L·R·皮蒂斯恩等. 发酵生产L-赖氨酸的方法[P]. 中国专利:ZL00134891.4, 2000-10-14.
[6]儿岛宏之，尾川由理，川村和枝等. 通过发酵生产L-赖氨酸的方法[P]. 中国专利: ZL03101776.2, 2008-04-30.
[7]贝蒂娜·默克尔，·普费弗勒，斯文·布兰德等. 利用棒状细菌发酵生产L-赖氨酸的方法[P]. 中国专利: 00130374.0, 2000-11-02.
[8]沈萍微生物学[M]，北京：高等教育出版社,2000.
[9]横井治彦，大西淳子，落合惠子等. 新型脱敏型天冬氨酸激酶[P]. 中国专利: 00808835. 7, 2002-06-26.
[10]布里吉特·巴瑟，卡罗林·赖内恩，贝蒂娜·默克尔等. 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸[P]. 中
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议