一种从Raffaelealauricola中提取腺苷的方法

一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法
技术领域
1.本发明涉及一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法。

背景技术：

2.raffaelea lauricola是食菌小蠹（ambrosia beetle）携带的高致病性伴生真菌，是引起树木枯萎病的病原真菌，人们一直期望揭示其致病机制，随着研究的深入，在该属其他物种中已分离到一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上存在极大应用前景。
3.腺苷是核苷类物质，可参与多种生长代谢途径，同时也是用于合成三磷酸腺苷（atp）、腺嘌呤、腺苷酸和阿糖腺苷的重要中间体。对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有重要生理作用。目前，尚未见raffaelea lauricola中获得腺苷的报道。

技术实现要素：

4.本发明的目的是公开一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，以促进其进一步在医药领域的研究和开发，为人类造福。
5.本发明采取的技术方案如下：一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，包括以下步骤：1）将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天即次级培养。
6.2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到3份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用尽可能少的氯仿或二氯甲烷溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用反相硅胶c
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为1:9部位洗脱液，旋蒸浓缩得组分a；4）将组分a通过hplc制备分离，以流动相体积百分数4%谱级甲醇：96%纯水等度洗脱，流速2ml/min，保留时间tr=12min，收集11.5 min-12.7 min洗脱液，旋蒸得到白粉末状产物腺苷，结构如下所示：
进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基：大米100g，木屑10g，加入纯水120ml，121℃高压灭菌，20min。
7.进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5cm，接种量为4块。
8.进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
9.进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶c
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粒径40-60μm，孔径120
å
。
10.进一步地，所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1。
11.进一步地，所述步骤4）中hplc制备所用的谱柱为ymc c
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谱柱250 mm
×
4.6mm,5μm。
12.本发明的显著优点：原料取材方便；分离纯化简单，成本低；制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
13.图1腺苷的1h nmr谱（dmso-d6）；图2腺苷的
13
c nmr谱（dmso-d6）；图3腺苷的dept135谱（dmso-d6）；图4腺苷的cosy谱（dmso-d6）；图5腺苷的hmbc谱（dmso-d6）；图6腺苷的hsqc谱（dmso-d6）。
具体实施方式
14.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
15.本发明所使用的raffaelea lauricola菌株编号为hulcr7161。
16.实施例11)取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g，纯水100ml，装入250ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在140r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养，按15wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g，木屑10g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min）中，继续在20℃条件下静置培养28天即次级培养。
17.2)收集培养28天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分
钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
18.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
18
硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为1:9部分旋蒸得粗品。
19.4)粗品用体积百分数6%甲醇/水（6ml/94ml）溶解，通过hplc制备分离，谱柱:ymc c
18
谱柱(250 mm
×
4.6mm，5μm)，以流动相体积百分数4%甲醇：96%纯水等度洗脱，流速2ml/min，保留时间tr=12min，收集11.5 min-12.7 min洗脱液，旋蒸得到白粉末状产物即腺苷。
20.经计算其提取率为1.31%（提取率%=腺苷重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
21.实施例21)取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到pdb 培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g，纯水100ml，装入250ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在180r/min、24℃条件下连续培养8天即初级培养，按20wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g，木屑10g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
22.2)收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1.5倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声60分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声60分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
23.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为1:9部分旋蒸得粗品。
24.4)粗品用体积百分数6%甲醇/水（6ml/94ml）溶解，通过hplc制备分离，谱柱:ymc c
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谱柱(250 mm
×
4.6mm，5μm)，以流动相体积百分数4%甲醇：96%纯水等度洗脱，流速2ml/min，保留时间tr=12min，收集11.5min-12.7min洗脱液，旋蒸得到白粉末状产物即腺苷。
25.经计算其提取率为1.56%（提取率%=腺苷重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
26.实施例31)取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4 块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g，纯水100ml，装入250ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在160r/min、26℃条件下连续培养10天即初级培养，按25wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g，木屑10g，加入纯水120ml，121℃高压灭菌20min）中，继续在28℃条件下静置培养40天即次级培养。
27.2)收集培养40天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1.5倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声90分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声90分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
28.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为1:9部分旋蒸得粗品。
29.4)粗品用体积百分数6%甲醇/水（6ml/94ml）溶解，通过hplc制备分离，谱柱:ymc c
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谱柱(250
×
4.6mm，5μm),以流动相体积百分数4%甲醇：96%纯水等度洗脱，流速2ml/
min，保留时间tr=12min，收集11.5 min-12.7 min洗脱液，旋蒸得到白粉末状产物即腺苷。
30.经计算其提取率为1.50%（提取率=腺苷重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

1.一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到3份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶c
18
进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9
→
9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为1:9部位洗脱液，旋蒸浓缩得组分a；4）将组分a通过hplc制备分离，以流动相4%谱级甲醇：96%纯水等度洗脱，流速2ml/min，保留时间t
r
=12min，收集11.5 min-12.7 min洗脱液，旋蒸得到白粉末状产物腺苷；所述步骤1）中改良的大米培养基：大米100g，木屑10g，加入纯水120ml，121℃高压灭菌20min。2.根据权利要求1所述的一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于：所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5cm，接种量为4块。3.根据权利要求1所述的一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于：所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。4.根据权利要求1所述的一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于：所述步骤3）中使用的反相硅胶c
18
粒径40-60μm，孔径120
å
。5.根据权利要求1所述的一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于：所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1。6.根据权利要求1所述的一种从raffaelea lauricola中提取腺苷的方法，其特征在于：所述步骤4）中hplc制备时所用的谱柱为ymc c
18
谱柱，250mm
×
4.6mm,5μm。