曹 琳
消声室制作
(宁波市药品检验所，浙江宁波315040)
[摘要] 目的：考察大孔树脂在丹参毛状根培养生产丹参酮过程中的原位富集。方法：在丹参毛状根培养过程中添加大孔树脂，利用高效液相谱法检测根内、培养液和树脂3个不同位点中3种主要丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA )的含量。结果：在选择的3种大孔树脂(X -5,AB -8,XAD -4)中，树脂X -5对丹参毛状根培养过程中生产的丹参酮具有最好的吸附效果，吸附在树脂加入后的4h 达到平衡，最大吸附量达到1 2m g g -1，总丹参酮吸附率达到92 4%。结论：大孔树脂X -5可以在丹参毛状根培养生产丹参酮的过程中有效地对丹参酮进行原位富集，简化了后续的提取分离步骤。 [关键词] 大孔树脂；吸附作用；丹参酮；丹参毛状根
[中图分类号]R 283 [文献标识码]A [文章编号]1001-5302(2007)17-1752-03
[收稿日期] 2006-12-15
[通讯作者] 曹琳,Te:l 138********,E-m ai:l porti a1104@yahoo .co m
丹参Salvia m iltiorrhiza Bunge 是我国传统常用中药，具有抗菌消炎、活血化瘀的功效，现代在心血管系统疾病中具有重要作用。丹参中主要的一大类生物活性成分是脂溶性的二萜醌类化合物(各种丹参酮)，供临床使用的总丹参酮是混合物，其中隐丹参酮(crypotansh i n one)、丹参酮I(tanshinone Ⅰ)和丹参酮ⅡA (tansh i n one ⅡA )3种丹参酮抗炎作用明显。由发根农杆菌感染植物形成的丹参毛状根系统，生长速度较快，遗传性稳定，成为了生产丹参药理活性物质的良好培养系统
[1-3]
。
但是在丹参毛状根培养中，毛状根所产生的大部
分丹参酮类物质主要存在于根内，培养液中的浓度很低，因此对丹参酮类物质的后续提取分离纯化步骤仍然比较繁琐。作者利用大孔吸附树脂在丹参毛状根培养生产丹参酮的过程中进行原位富集的研究，以期在毛状根合成丹参酮的同时有效地将丹参酮类物质提取出来，简化后续分离步骤，并且为今后工业化生产丹参活性成分提供依据和有效的方法。1 材料与方法
1.1 材料与仪器 Ag ilent l 100高效液相谱，美国安捷伦公司。大孔吸附树脂XAD -4,Sig m a 公司。
大孔吸附树脂AB -8和X-5，南开树脂厂。隐丹参
酮(110852-9903，丹参酮Ⅰ(110867-200104)和丹参酮ⅡA (110766-200010)，从中国药品生物制品检定所购得。
1.2 丹参毛状根的培养 丹参毛状根是用发根农杆菌ATCC15834感染丹参苗获得的
制作简单机械[4]
，并在无激素的
M S -N (不含硝酸铵；蔗糖含量30g L -1
)液体悬浮培
养基中进行继代培养。将0 3g 湿根(液体培养3~4周的嫩根)接种于装有40mL M S -N 液体培养基的200mL 摇瓶中作为试验材料。25 ,110~120r m i n -1
，黑暗下悬浮培养。
1.3 大孔吸附树脂的预处理 使用前将大孔树脂用甲醇在室温下浸泡24h ，然后用纯化水充分清洗并用
布氏漏斗抽干。将干树脂称重，取适量(根据具体试验要求)干树脂用
30 m 的尼龙滤布
(12c m 12c m )包成小树脂袋。将包好的树脂袋浸泡在50mL 培养液中平衡4h 后高温高压灭菌(浸泡在培养液中)备用。
1.4 毛状根干重和丹参酮含量的测定 将收获的毛状根用纯化水清洗和过滤3遍，然后用滤纸吸去多余水分，放入温度为45~50 的烘箱中干燥直至其质量恒定，测其干重。毛状根中丹参酮的提取方法是：称取100m g 干根粉末加入8mL 甲醇共同研磨5m i n ，然后超声萃取1h 。提取混合物静置过夜，离心，将得到的提取液进行真空干燥。培养液中丹参酮的提取方法是：取5mL 过滤后的培养液，加入同样体积
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的二氯甲烷，充分混匀，静置2h后取出4mL上清液；再用同样的方法反复萃取2次,3次得到的萃取液合并；将得到的萃取液真空干燥。树脂中丹参酮的解析方法是：树脂袋用100mL甲醇浸泡，常温下在转速为120r m i n-1的摇床上解析24h；将得到的解析液真空干燥。所有真空干燥得到的残余物均用0 5 mL的谱甲醇溶解,0 45 m的滤膜过滤待测。丹参酮的含量用H PLC测定，流动相为乙腈-水(63 37)，流速1 0mL m i n-1，检测波长280nm。
1.5 试验方案 向培养22d的丹参毛状根中加入灭好菌的树脂袋，根据具体试验内容定点进行取样测定。分别测定毛状根的干重，毛状根、树脂和培养液中丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA)的含量。
2 结果与讨论
2.1 3种大孔树脂在丹参毛状根合成丹参酮过程中的原位富集效果比较 从表1可知,3种大孔树脂(X-5,AB-8,XAD-4)的加入都对毛状根的生长产生了一定的抑制作用，这可能是由于树脂吸附了一定的培养液成分以及阻碍了部分毛状根的生长空间造成的。但是3种树脂的加入没有对丹参毛状根中的总丹参酮含量造成抑制，并且树脂X-5的加入明显提高了丹参毛状根中总丹参酮的含量。本研究的主要目的是考察树脂是否能在丹参毛状根合成丹参酮的过程中有效地进行原位富集，表1的结果表明所选用的3种大孔树脂都能有效地吸附丹参毛状根生产的丹参酮类物质，其中树脂X-5对总丹参酮的吸附率最高，达到92 4%，树脂AB-8和XAD-4对总丹参酮的吸附率则分别为83 6%和76 7%。树脂吸附过程中，树脂内部孔径是吸附质扩散的路径，在比表面积一定的情况下，孔径越大，吸附质的扩散速度也越大，有利于达到吸附和解吸平衡[5]。本试验选择的3种大孔吸附树脂具有相近的比表面积，而孔径则具有较大差别，树脂X-5, AB-8和XAD-4的孔径大小范围依次为29~30 n m,13~14n m和4nm。因此X-5对总丹参酮吸附率高的可能原因就是因为其孔径较大，有利于吸附和解吸过程的进行。因此选择树脂X-5作为进一步研究使用的吸附剂。
2.2 树脂X-5对总丹参酮的静态吸附动力学及对总丹参酮分布的影响 树脂对目标产物的吸附速率是考察树脂吸附能力的一个重要指标。图1的结
表1 不同树脂(X-5,AB-8,XAD-4)对丹参毛
状根生长、丹参酮生产和原位富集效果的比较树脂
类别
根干重
/g L-1
发光标识总丹参酮含
量/m g g-1
总丹参酮产
量/m g L-1
总丹参酮
吸附率/%
对照8 90 0 620 46 0 134 10 0 74-
X-57 59 0 310 62 0 0324 70 0 5392 4 2 7
AB-87 36 0 310 48 0 0123 53 0 3783 6 1 7 XAD-47 73 0 350 45 0 223 48 0 4476 7 4 6
注：总丹参酮含量或产量是指隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ
A 的含量或产量之和；在培养的第30天(即树脂袋加入后的第8天)取样进行检测
果显示树脂中吸附的总丹参酮产量在树脂X-5加入丹参毛状根培养体系后迅速增大，在加入后4h 左右吸附达到平衡，表明树脂X-5对总丹参酮的吸附速率是较快的。从图1中还可以看到，在树脂X-5加入毛状根培养体系后，随着树脂中吸附的总丹参酮产量的不断提高，丹参毛状根中总丹参酮的产量不断下降，在树脂吸附达到平衡的4h左右趋于稳定；而培养液中总丹参酮产量从树脂X-5加入开始直到吸附达到平衡一直维持在一个很低的浓度水平，没有发生变化。这一结果说明在树脂X-5添加到培养体系中后，由于树脂不断吸附培养液中的丹参酮，因此丹参毛状根中的丹参酮不断向根外释放以使毛状根和培养液中的丹参酮产量达到平衡；而培养液中丹参酮的产量在整个吸附过程中一直维持在一个很低的水平，这可能是由于丹参酮从培养液向树脂中传递速率很快的结果。因此，树脂X-5的加入改变
了总丹参酮在丹参毛状根培养体系中的分布，大部分丹参酮从毛状根内转移到了树脂这样一个胞外存贮位点里，有效地简化了后续分
离步骤。
图1 树脂X-5对总丹参酮的静吸附动力学及
对总丹参酮分布的影响
2.3 树脂X-5对总丹参酮及单个丹参酮的最大吸附量 考查树脂吸附能力的另一个重要指标是树脂对目标产物的最大吸附量。表2是树脂X-5对总丹参酮以及3种主要丹参酮的最大吸附量结果。
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树脂X-5对总丹参酮的最大吸附量可以达到1 2 m g g-1，其中隐丹参酮所占比例最高，其次是丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA所占的比例最低。这一结果表明树脂X-5对目标产物总丹参酮具有较高的吸附量，但是对3种主要丹参酮的吸附量存在较大的差别，这可能是由于3种主要丹参酮在丹参毛状根中原有的含量不同以及在培养液中的溶解度不同造成的。表2 树脂X-5对总丹参酮及单个丹参酮的最大吸附量
指标最大吸附量/m g g-1
隐丹参酮0 54 0 06
丹参酮Ⅰ0 42 0 08
丹参酮Ⅱ
A
0 24 0 05
总丹参酮1 20 0 07
3 结论
在丹参毛状根培养生产丹参酮的过程中，添加大孔树脂X-5对丹参酮进行原位富集的效果比大孔树脂AB-8和XAD-4好。
树脂X-5对丹参毛状根生产的丹参酮具有良好的原位富集效果，吸附在树脂加入后4h达到平衡，最大吸附量达到1 2m g g-1，总丹参酮吸附率达到92 4%。
在丹参毛状根培养过程中加入大孔吸附树脂X -5，可以有效地改变总丹参酮在培养体系中的分布，使大部分丹参酮在培养的同时就转移到树脂这一胞外存储位点中，简化了后续提取分离步骤。[参考文献]
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In situ extracti on effect of macroporous resi ns on tanshi nones i n
Salvi a m iltiorrhiza hairy root culture
CAO L in
蓄电池恒温箱(N ingbo Instit ute for D rug Control,N ingbo315040,Chi na)
[Abstract] O bjective:T o investi ga te the i n situ extraction effect o f m acroporous resi ns on tansh i nones i n Salvia m iltiorrh i za ha i ry root.M ethod:M acropo rous resins were added to S.m iltiorrhiza ha i ry roo t culture and t he contents of three m a j or tansh i nones (crypotans h i none,tans h i noneⅠand tansh i noneⅡ
A
)i n roo t,m ed i u m and resi n w ere analyzed by H PLC.R esu lt:The m acroporous res i n X-5had the best adsorption effect on t o ta l tanshi nones among t hree chosen res i ns(X-5,AB-8,XAD-4)dur i ng t he S. m iltiorrhiza ha i ry root cu lt ure.T he adso rpti on reached equ ili bri um afte r four hours w i th the addition o f the resin X-5.T he satura ti on o f X-5on to tal tanshinones was1 2m g g-1res i n and the adsorpti on ra ti o reached92 4%.Conclusion:T he m acroporous res i n X -5cou l d extract tansh i nones in sit u e ffecti v ely during S.m iltiorrhiza ha i ry root cult ure and si m plif y the f u rt her separa ti on process.
[K ey words] m acroporous res i n;adsorption;tansh i nones;Sal via m iltiorrh i za ha iry root
[责任编辑 鲍 雷]
更 正
因本刊工作失误，将2007年第15期书脊 第十五期 错写成 第十三期 。对于由此给您带来的不便，本刊表示十分歉意。
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