目录
第一部分 三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）的Ｄ－氨基酸氧化酶 ． 基因在Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中的表达研究 1 提要 ------------------------------------------------------------------------- 1
2 前言 ------------------------------------------------------------------------- 2
3 材料与方法 ---------------------------------------------------------------- 8
4 结果 ------------------------------------------------------------------------ 16
5 讨论 ------------------------------------------------------------------------- 22
6 结论 ------------------------------------------------------------------------- 25
7 参考文献 ------------------------------------------------------------------ 26
第二部分 构建强化表达ＳＡＭ合成酶的重组Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及 s100无人机
Ｓ－腺苷甲硫氨酸的制备
bttt1 提要 ------------------------------------------------------------------------- 30
2 前言 ------------------------------------------------------------------------- 31
3 材料与方法 ---------------------------------------------------------------- 34
4 结果 ------------------------------------------------------------------------ 37
5 讨论 ------------------------------------------------------------------------- 43
6 结论 ------------------------------------------------------------------------- 45
7 参考文献 -------------------------------------------------------------------46
hcpl2630致谢 ----------------------------------------------------------------------------- 49
发表论文及专利 -------------------------------------------------------------- 50
中文摘要 ---------------------------------------------------------------------- ⅰ
英文摘要---------------------------------------------------------------------- ⅳ
第一部分 三角酵母（Trigonopsis variabilis）Ｄ－氨基酸氧化酶 基因在甲醇酵母（Pichia pastoris） 中的表达研究
提 要
Ｄ－氨基酸氧化酶是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）为辅基的典型黄素蛋白酶，催化Ｄ－氨基酸的氧化脱氨反应生成相应的酮酸和氨。鉴于此酶在两步酶法合成７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）中的关键作用，我们利用甲醇酵母表达来源于三角酵母的Ｄ－氨基酸氧化酶。首先通过ＰＣＲ扩增得到了来源于三角酵母的去除内含子的Ｄ－氨基酸氧化酶的基因，然后将该基因克隆到Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ胞内表达载体ｐＰＩＣ３．５ｋ上。表达质粒ｐＰＩＣ３．５ｋ－ＤＡＡＯ用ＳａｌＩ限制性内切酶线性化后转入宿主菌Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５ （ｈｉｓ－ｍｕｔ＋）中，以ＳａｌＩ线性化的空载质粒ｐＰＩＣ３．５ｋ转化的菌株作为对照。借助ＭＭ和ＭＤ平板以及ＰＣＲ方法筛选得到了重组Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株。酶活力测定和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明在甲醇的诱导下， Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ能够在胞内表达 Ｄ－氨基酸氧化酶。依据酶的活力筛选得到了高效表达Ｄ－氨基酸氧化酶的重组菌株ＰＤ２７并且在一升的发酵罐中对该高表达菌株进行了高密度发酵。Ｄ－氨基酸氧化酶的酶活可达２３，０００ Ｕ／Ｌ。最后，用正己醇破碎细胞，酶的粗提液中Ｄ－氨基酸氧化酶的比活达１．４６ Ｕ／ｍｇ 蛋白。 孕妇袜
前 言
自青霉素发现以来，β－内酰胺类抗生素已经成为临床上应用量最大、最有效的药物之一。但是随着人类日益广泛的使用，细菌的耐药性随之出现并日趋严重。当代对付细菌抗药性的最有力的手段之一就是发展半合成青霉素（ＳＳＰ）和半合成头孢菌素（ＳＳＣ）之类的新型半合成β－内酰胺类抗生素（ＳＳＡ）。在近现代β－内酰胺类抗生素工业生产过程中，广泛采用的方法是首先依靠发酵法生产青霉素Ｇ、Ｖ和头孢菌素Ｃ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ， ＣＰＣ）等抗生素；第二步则是用化学裂解法或酶法水解抗生素生产母核６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）、７－氨基脱乙酰基烷酸（７－ＡＤＣＡ）和７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）等关键中间体；最后将这些母核与不同的新侧链以化学法或酶法连接合成系列的更具药效的半合成抗生素。
在生产ＳＳＣ中，７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）是一种很关键的中间体。用化学裂解法生产７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）技术在在西方已沿用几十年。但由于环境污染严重，已逐步趋于淘汰，取而代之的是酶法制备。此外，酶法制备７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）有助于可持续发展，具有明显的社会效益。研究证明，两步酶反应的生物转化技术具有良好的产业化前景。同时，随着酶法工艺的改进和完善，特别与头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ）发酵相配套衔接以及固定化酶的国产化，将会建立起以我国自主开发的工业菌种进行头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ）发酵生产和酶法制备７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）技术，并进入世界先进行列。在酶法生产新型半合成抗生素中，应用的一个重要的酶是Ｄ－氨基酸氧化酶。
Ｄ－氨基酸氧化酶（Ｄ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｓｅ． ＥＣ１．４．３．３． ＤＡＡＯ）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）作为辅基的典型黄素酶，天然酶蛋白为８６ｋＤａ的二聚体，由两个相同的亚基组成，每个亚基含有一个铁原子。酶的等电点为４．６［１］。此酶特异性催化Ｄ－型氨基酸氧化脱氨生成酮酸，同时对头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ）具有
催化活力。此酶与ＧＬ－７－ＡＣＡ 酰化酶相结合，在两步酶法合成７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ） 中起关键作用。头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ）经Ｄ－氨基酸氧化酶催化能够氧化脱氨产生α－酮基己二酰－７－ＡＣＡ（ＫＡ－７－ＡＣＡ），在Ｈ２Ｏ２存在下，后者易氧化脱羧形成ＧＬ－７－ＡＣＡ。最后，以ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶催化ＧＬ－７－ＡＣＡ脱酰生成７－ＡＣＡ（Ｆｉｇ．１）。此外，Ｄ－氨基酸氧化酶也能被用于生产α－酮酸和纯的Ｌ－型氨基酸［２，３］。
鉴于７－ＡＣＡ是生产临床半合成头孢菌素类抗生素的关键原料，市场需求量可观，Ｄ－氨基酸氧化酶作为重要的工业用酶，受到生物学工作者和产业部门的关注，对该酶进行的基础性研究和生物催化剂的研制开发具有重要的经济意义。
生物学家对Ｄ－氨基酸氧化酶的研究已经经历了漫长的历史，早在６０多年前Ｋｒｅｂｓ
Ｆｉｇ．１． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＤＡＡＯ： ＤＡＡＯ ｃａｔａｌｙｓｅｓ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｐｈ Ｃ ｉｎ
直缝焊
ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｔｏ ｆｏｒｍ ｋｅｔｏ－ａｄｉｐｙｌ－７－ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ （ＫＡ－７－ＡＣＡ）， ｈｙｄｒｏ
ｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉａ． Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ， ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＫＡ－７－ＡＣＡ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ O O 2+ O 2 + H 2- NH 3 - H 2O D-amino acid oxidase O
HOOC
+ H 2O 2
- CO 2 - H 2spontaneously
O O O HOOC ceph C
KA-7-ACA GL-7-ACA + H 2HOOC _GL-7-ACA acylase H 2O 7-ACA
等［４］首次在猪肾脏中就发现了该酶的活性，其后的研究表明Ｄ－氨基酸氧化酶广泛存在于人、兔、鼠等脊椎动物的肝、脑和其他组织器官中，肝脏和肾脏中尤其丰富，以后还陆续报道小球藻以及多种微生物中也有Ｄ－氨基酸氧化酶的存在。
Ｄ－氨基酸氧化酶溶液对１０ｍＭ ＥＤＴＡ 彻底透析后，酶活力不发生变化。三角酵母来源的Ｄ－氨基酸氧化酶对头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ），苯丙氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸的Ｋｍ值分别为１３，１０，
０．７６和０．１２。高效液相谱和酶分析指出黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）是Ｄ－氨基酸氧化酶的辅助因子，并可能存在有异构酶，尽管目前尚未能对这些异构酶进行分离和鉴定［５］。研究还表明Ｄ－氨基酸氧化酶对Ｃｕ２＋，Ｈｇ２＋，Ｆｅ２＋等金属离子十分敏感，微量存在即会使酶迅速失活。从Ｄ－氨基酸氧化酶的抑制实验可知，典型的Ｄ－氨基酸氧化酶抑制剂都有一个功能羧基基团，当该基团的负电荷被邻近的芳香基团、共轭双键稳定时（如苯甲酸），这种抑制作用显得更强［１］。此外，芳香族的磷化物以及硫的含氧酸，醛类，硫醇类，硝基苯，硝基苯胺，马来西亚胺，甾族化合物等许多物质对此酶也有抑制作用［６，７］。
悬浮于２０ｍＭ焦磷酸缓冲液（ｐＨ８．３）中的Ｄ－氨基酸氧化酶溶液在－２０℃冷冻状态下十分稳定，冻融并不损伤酶活，但室温放置稳定性下降［１］。当以头孢菌素Ｃ（ＣＰＣ）为底物时，三角酵母完整细胞经２４小时，６次重复使用后，Ｄ－氨基酸氧化酶活力降为起始活力的４０％［８］。不存在底物情况下，同样温育２０小时，也产生类似结果。由此说明，上述酶活力损失并不是蛋白质水解和反应过程中产生的过氧化氢所致，Ｄ－氨基酸氧化酶的短暂半衰期（１０－１５小时）可能是酶蛋白本身内在的不稳定性造成的。但是，Ｄｅｙ等［９］，将三角酵母Ｄ－氨基酸氧化酶的稳定性不佳归因于反应过程中较高的氧分压和过氧化氢的存在，当在无氧、不存在Ｈ２Ｏ２时，酶的半衰期可延长到５０－７５小时（ｐＨ７．８－８．２，２０－２５℃磷酸缓冲液）。酶溶液中添加ＦＡＤ，ＤＴＴ或蛋白酶抑制剂时，Ｄ－氨基酸氧化酶的稳定性不受影响。三角酵母细胞可在０－５℃，ｐＨ６－６．５，氮气中保存一周，酶活力不会损失［１０］。
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关于Ｄ－氨基酸氧化酶的生理功能，目前尚不很清楚，Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ等［１１］认为在一些动物中，Ｄ－氨基酸氧化酶可被用于清除细胞老化时所产生的Ｄ－氨基酸氧化酶，
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