白蛋白的纯化方法

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本发明涉及一种白蛋白的纯化方法，更具体地说是涉及从人体血浆组份Ⅴ中纯化白蛋白的方法。
众所周知，白蛋白是血浆中最大部分的蛋白质，在血浆组份Ⅴ中含量尤为丰富，白蛋白的浓度约为40克/升血浆。单体形式的白蛋白分子量为66，000至69，000。一般来说，白蛋白可以从人血中分离出来首先，将血液分离成许多小组份，如血浆、血清。血细胞等，接着再将其分离成许多亚组份，例如组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、和Ⅴ。白蛋白可进一步从组份Ⅴ沉淀中浓缩并纯化而得到。从血浆中纯化白蛋白的最普通方法是Cohn的冷醇沉淀方法[Cohn等，Journal American Chemical Society 68，459-475(1946)]。Cohn方法是通过用乙醇浓度的递增及pH递减的顺序沉淀来分离血浆蛋白，所需的白蛋白大多存在于组份Ⅴ沉淀中。
当白蛋白用于化学领域或医药领域中时，一般都需要高纯度、稳定且浓度高的产品，必须将混杂于白蛋白中的其它污染蛋白去除掉，所以，纯化白蛋白的步骤，也被称为组分Ⅴ加工的步骤是必不可少的。在加醇沉淀法中，由于沉淀过程中会使白蛋白变性及沉淀中的白蛋白的机械损失，从组分Ⅴ中对白蛋白加工的得率低达10-15%。另外，在该组分Ⅴ加工中也会形成白蛋白的聚合物及二聚物，这不仅减少了纯化白蛋白单体的得率，另外由于白蛋白聚合物引起不需要的免疫应答，故这种产物也会对人体产生副作用。因此，长期以来人们希望能开发出一种从组分Ⅴ沉淀中纯化白蛋白单体的新方法。
本发明的一个目的在于提供一种纯化白蛋白的新方法，用该方法纯化可得到高纯度的白蛋白单体，其聚合物和二聚物形式的白蛋白收率则极低。
本发明的白蛋白纯化方法的特征在于该方法包括下列步骤(Ⅰ).将纯化白蛋白系统中的乙醇浓度调节至8-13%(重量)，pH调节至4.5-4.8;
(Ⅱ).从溶液中除去沉淀;
(Ⅲ).将滤液的pH增至4.8-6.5，从溶度中除去乙醇;
(Ⅳ).从溶液中除去沉淀物。
下面，我们将对本发明的白蛋白纯化方法作详细的阐述。
在-3～8℃温度下，将适量组分Ⅴ沉淀溶于8～13%，较好地溶于9～11%的乙醇水溶液中以得到蛋白质浓度为5～8%的混合物，将该溶液的pH进一步调节为4.5～4.8。通过过滤除去沉淀。
将滤液的pH调节至约4.8～6.5，较好调至5.1～5.3后，从溶液中除去乙醇，直至其中的乙醇浓度低于0.05%为止。所述的从滤液中除去乙醇的步骤可通过超滤渗析、基于分子大小分离溶液组份的压力驱动膜方法来进行，在渗析过程中，盐浓度的减少率与醇浓度的减少率相同，若溶液混浊，再进行过滤以得到纯化的白蛋白溶液。
可用常规的方法使所述的白蛋白溶液稳定。通常向溶液中对于每克蛋白质加入0.08毫摩尔N-乙酰基DL-氨酸和辛酸钠。将溶液的pH调节至6.8-7.2。使调节好的溶液在60℃下加热消毒10至20小时。
用于本发明中的组分Ⅴ沉淀可从Cohn方法得到在-5℃及搅拌下，通过毛细喷嘴向血浆中加入乙酸盐缓冲液及乙醇-水混合物(0.163%(摩尔)乙醇)，加入速率以50cc至500cc/分钟递增，通过加入乙酸盐缓冲液可使pH控制在4.8，最终得到了沉淀形式的组分Ⅴ。
本发明的方法是一个简单而有效的方法，系将组分Ⅴ加工方法与超滤纯化方法的构思加以合并改进以替代组分Ⅴ加工的方法。根据本发明的方法，白蛋白的纯度高于97%，这与组分Ⅴ加工方法所得的纯度相当。值得注意的是，用本发明方法纯化的白蛋白中，单体形式含量较高，白蛋白中其聚合物和二聚体的含量比用常规组分Ⅴ加工方法纯化所得的白蛋白中的含量要低得多。因此，用本发明方法纯化的白蛋白可放心地用于中而不会产生任何由白蛋白聚合物所引起的不需要的免疫反应。
下面根据实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明不为这些实施例所限定。
实施例1在搅拌及3℃温度下，向盛有747克水的罐中依次加入212.44克组分Ⅴ沉淀及38.4克95%酒精。使沉淀悬浮有乙醇-水中后，用0.5M NaOH和pH4.0缓冲液使混合物的pH调节至4.58。称取0.8克硅藻土预置于滤器上，用60℃或60℃以上的注射用水冲洗NA 30KP和/或NA600RP滤器时间不少于15分钟，然后用冷注射用水冲洗直至滤器中流出液体的水温为10℃或更低。混合物过滤后，滤器用40.0克10%乙醇-水后洗。加入0.5M NaOH使滤液的pH调至5.42，用超滤(UF)系统渗透来进行初步浓缩，向超滤系统的容量罐中加入注射用冷水以进行恒体积洗涤。最后，使滤液浓缩至22～24%固体。
在适当搅拌下，以1.0毫升/分钟的速率向产物溶液中加入4.53毫升稳定溶液(N-乙酰基DL-氨酸和辛酸钠)。混合10分钟后，加入0.5M NaOH使稳定的白蛋白材料的pH调节至6.9。在60℃水浴中加热产物10个小时以得到pH6.9的20%白蛋白溶液。
实施例2除了用178.01克组分Ⅴ、41克95%酒精和753克水的混合物，并将其pH调至4.62外，其它用实施例1的方法可得到纯化的白蛋白溶液。
比较实施例将组分Ⅴ沉淀在0℃下溶于6份体积水中，在约2小时内向溶液内加入1体积53.3%乙醇，在加入期间使温度降至-2至-3℃。轻轻搅拌所得的混浊溶液2小时，然后通过过滤使其澄清。
使温度降至-5℃，同时将乙醇浓度增加至40%时白蛋白从滤液中沉淀出来。为了使沉淀对乙酸的吸附最小，通过加入足量的碳酸氢钠而使pH值在5.0至5.2间，接着在-5℃温度下于2小时内对于每毫升滤液加入545毫升95%冷乙醇。在-5至-6℃下通过离心或过滤可以得到沉淀出来的白蛋白。
试验将实施例1和2纯化所得的产物与对比实施例中纯化所得的产物就白蛋白纯度及HPLC分析所得的分子大小分布状态等几方面进行比较，结果列于下表Ⅰ中。
表Ⅰ 白蛋白质量试验
由上可知，用实施例1和2的方法纯化的白蛋白，其单体含量较高，聚合物、二聚体、N-基体和碎片的含量较比较实施例的产物低。

权利要求

1.一种白蛋白的纯化方法，其特征在该方法包括下列步骤(Ⅰ).将纯化白蛋白系统中的乙醇浓度调节至8～13%(重量)，pH调节至4.5～4.8；(Ⅱ).从溶液中除去沉淀；(Ⅲ).将滤液的pH增至4.8～6.5，从溶液中除去乙醇；(Ⅳ).从溶液中除去沉淀物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纯化白蛋白系统包括5～8%(重量)白蛋白和其它蛋白质，8～13%(重量)乙醇及水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其中将组分Ⅴ溶于9～11%乙醇水溶液中以得到纯化白蛋白系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中的溶解过程在-3～8℃温度下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(Ⅲ)中pH被调节至5.1～5.3。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于在步骤(Ⅲ)中，从滤液中除去乙醇使其浓度低于0.05%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于用超滤渗析法除去乙醇。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过过滤除去沉淀。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其中过滤在硅藻土滤器上进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法进一步包括步骤(Ⅴ)向溶液中相应于每克蛋白质加入0.08毫摩尔N-乙酰基DL-氨酸和辛酸钠后对白蛋白溶液进行稳定和消毒。

全文摘要

本发明涉及一种白蛋白的纯化方法，其特征在于将白蛋白纯化系统中的乙醇浓度调节至8～13％(重量)，pH调节至4.5～4.8；除去沉淀；将滤液的pH增至4.8～6.5，再从溶液中除去乙醇，接着从溶液中除去沉淀。根据该方法所得的白蛋白纯度高于97％。值得注意的是与常规的纯化方法相比，本发明纯化所得的白蛋白单体含量高，聚合物及其它杂质形成少，可以有效地用于及化学领域。