吴文华;张继业;王宇;梁继超;韩凤梅;陈勇
【摘 要】superboost
目的:研究葛根素影响自发性高血压大鼠血压的分子机制.方法:12只成年自发性高血压大鼠(SHR)随机分为给药组和对照组,给药组灌胃葛根素(36mg·kg·d-1),对照组灌胃等量去离子水.每周测血压1次,4周后处死动物,分别检测肾脏、肝脏和血管中内皮素-1(ET-1)、一氧化氮合酶(NOS)、细胞素P450 4A1(CYP4A1)和血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT-1)mRNA和蛋白质的表达量,检测血浆中血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量.结果:葛根素给药4周后,可显著上调肾脏、肝脏和血管中eNOS mRNA的表达,下调肝脏中ET-1的蛋白含量;显著上调肾脏和血管中CYP4A1 mRNA和蛋白水平,以及AT-1 mRNA水平.结论:葛根素可能主要通过上调eNOS和下调ET-1的表达,降低SHR的血压;通过激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和花生四烯酸羟化代谢途径,拮抗降压作用. 【期刊名称】《中医药学报》
【年(卷),期】2010(038)004
燕窝 亚硝酸盐
【总页数】4页(P26-29)
【关键词】葛根素;自发性高血压大鼠;一氧化氮合酶;内皮素-1;细胞素P450羟化酶;肾素-血管紧张素-醛固酮系统
【作 者】吴文华;张继业;王宇;梁继超;韩凤梅;陈勇
【作者单位】湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062;湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062;湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062;湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062;湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062;湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062
【正文语种】中 文
【中图分类】R966
内皮来源的血管活性物质在血压调节中有重要作用，其中，一氧化氮(NO)是体内最主要的舒血管内皮来源物质［1，2］，内皮素 －1(ET －1)是强缩血管内皮来源物质［3］。肾素
－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)的激活对高血压的发生、发展及靶器官的损害有主要作用［4］，是药物产生降压抵抗的重要原因。同时，激活花生四烯酸的羟化代谢途径亦是目前比较明确的药物产生降压抵抗的重要原因。花生四烯酸经细胞素P450羟化酶 (CYP4A1)代谢的主要产物羟基二十碳四烯酸(20－HETE)，可以抑制血管平滑肌钙离子激活的钾通道活性，使细胞去极化，最终收缩血管［5］。因此，组织中CYP4A1活性的高低与血压密切相关，CYP4A1的下调表达可降低血压［6］。另外，20－HETE也可作为 ET－1、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的第二信使升高血压［7］。
葛根素(Puerarin，Puer)是豆科植物野葛或甘葛藤的主要有效成分，它能上调正常大鼠和心肌缺血大鼠血浆和脏器中一氧化氮合酶(NOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性［8，9］，也能减少高血压病人和糖尿病肾病大鼠血浆和肾脏中内皮素(ET)的含量［10，11］。但葛根素对血压的影响机制目前仍不十分清楚，本文研究了葛根素对自发性高血压大鼠(SHR)肾脏、肝脏、血管组织和血浆中NOS、ET－1、血管紧张素Ⅱ－1型受体(AT－1)、CYP4A1基因与蛋白表达水平及其对SHR血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)含量的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器 成都仪器厂RM－6240BD型生理信号采集处理系统;SIGMA 2K15C台式高速离心机;日本岛津UV－1601紫外分光光度计;法国Jouan公司超低温冰箱;美国Biorad公司MiniOpticon荧光定量PCR仪器;中国科技大学实业总公司γ－911全自动放免计数仪;美国Biochemi公司凝胶成像分析系统;北京六一仪器厂DYY－6C型电泳仪。
1.2 试剂 葛根素对照品(纯度大于98%)购于中国药品生物制品检定所;醛固酮、血管紧张素Ⅱ、内皮素－1放射免疫测定试剂盒、一氧化氮合酶化学比法测定试剂盒购于北京华英生物研究所;总蛋白提取试剂盒购于普利莱基因技术有限公司;考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物公司;预染蛋白质分子量标准购于fermentas公司;β－actin抗体、CYP4A1抗体购于美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG购于天根生化科技有限公司;Western杂交显影用增强化学发光试剂ECL购于美国pierce公司。 2 实验方法
2.1 动物分组及给药 12只SPF级成年自发性高血压大鼠(SHR)(体重190±20g，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证:SCXK(京)2007－0001)，随机分为对照组和给药组，每组6只，饲养于SPF动物房。每日下午给药组灌胃葛根素36mg·kg·d－1，
连续灌胃4周。对照组灌胃等体积生理盐水。大鼠饲料为湖北省医学实验动物研究中心统一配制的全价饲料。
2.2 大鼠尾动脉血压测定 清醒状态下，分别于用药前、用药后1周、2周、3周、4周末，尾套法测定动物收缩压，平行测定3次，且误差在5mmHg以内，取3次血压读数平均值。
2.3 血浆中ALD和AngⅡ的测定 取大鼠眼眶血快速加入含有肝素的离心管中，颠倒混匀，4℃、3000rpm离心5min，取上清液，参照ALD和AngⅡ测定试剂盒说明书，进行放射免疫分析测定。
2.4 组织中 ET－1、eNOS、CYP4A1、AT－1 mRNA 表达量测定 4周后处死大鼠，取肝、肾、血管，使用Trizol试剂提取各组织的总mRNA，引物序列见表1。
表1 ET－1，eNOS，CYP4A1，AT－1和GAPDH的正向引物和反向引物
取总RNA1μg，按照说明书进行逆转录合成cDNA。荧光定量 PCR反应条件为:95℃，3min;94℃，30sec;58.5℃，30sec;72℃，30sec;从第二步开始40 个循环，反应体系为20μL。选取15～25个扩增循环数(cycle threshold，Ct)的荧光信号，计算三个平行复孔的
扩增效率，计算ΔCt(=Ct内参基因－Ct目的基因)和ΔΔCt(=(Ct实验组内参基因－Ct实验组目的基因)－(Ct对照组内参基因－Ct对照组目的基因))，并计算实验组目的基因与对照组目的基因的差异表达量2－ΔΔCt(=实验组目的基因/对照组目的基因)。
2.5 组织 血浆中ET－1和NOS含量测定 参照试剂盒说明书，测定肝及肾提取上清液中NOS与ET－1的含量。
2.6 组织中CYP4A1含量测定 取适量组织样品，用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白质，经SDS－PAGE凝胶电泳分离后，采用电印迹转移法将蛋百质转印至PVDF膜上，用PBST溶液(含5%脱脂奶粉)封闭1h后，分别加入β－actin抗体和CYP4A1抗体，4℃孵育过夜，室温下PBST溶液洗膜后加入辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG孵育1.5h，再用PBST溶液洗膜后与Western杂交显影增强化学发光试剂试剂ECL反应，拍照。以软件BandScan5.0扫描灰度，以CYP4A1与β－actin条带的灰度值比值来估算CYP4A1的含量。
2.7 统计学分析 实验数据用SPSS statistics 17.0统计软件进行分析，组间比较使用t检验，以P＜0.05为有显著性差异，结果以平均数±标准差表示。
3 结果
3.1 对SHR血压的影响(见图1)
电热手套
对照组1～4周内血压基本无变化，给药组血压随给药时间延长逐渐下降，到第四周时血压下降最大，且与对照组相比有显著性差异(P﹤0.05)。
图1 葛根素对自发性高血压大鼠(SHR)血压的影响
3.2 对血浆中ALD和AngⅡ含量的影响
与对照组相比，给药组血浆中AngⅡ及ALD含量无明显变化。
3.3 对组织中 ET －1，eNOS，CYP4A1，AT －1 mRNA表达的影响(见表2)
与对照组相比，给药组肾脏中 ET－1、eNOS、CYP4A1、AT－1 mRNA的表达量均显著增加，血管中eNOS、CYP4A1、AT－1 mRNA 的表达量显著增加，肝脏中eNOS和CYP4A1 mRNA的表达量显著增加(结果见表2)。
表2 不同组织中ET－1，eNOS，CYP4A1和AT－1的mRNA的相对表达量(n=6，±s)注:与对照组比较，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。
3.4 对组织与血浆中ET－1和NOS含量的影响
与对照组相比，给药组肾脏、肝脏和血管中NOS的含量及肾脏和血浆中ET－1含量无明显变化，但肝脏中ET－1的含量显著减少(结果见表3)。
表3 组织与血浆中ET－1的含量(n=6，±s)注:与对照组比较*P﹤0.05螺钉输送机
3.5 对组织中CYP4A1含量的影响背板制作
与对照组相比，给药组肾脏和血管中CYP4A1含量均显著增加(P＜0.05)，肝脏中CYP4A1的量无明显变化(见图2，3)。
图2 CYP4A1和内参照β－actin的Western Blot图(A:对照组，B:给药组)
图3 Western Blot条带密度经BandScan5.0扫描后得到的CYP4A1蛋白相对量柱型图(n=3，±s;*P﹤0.05)
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