实验二 SDS聚- 丙烯酰胺凝胶电泳法
1原理
1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理
1.1.1性能 聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对 pH 和温度变化比较稳定， 在很多溶剂中不溶， 是非离子型的， 没有吸附和 电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动， 并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的 制备，不致污染样品。
1.1.2制备原理
聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺 （ 自动化监测
Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺 （Bis） 在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合 和光聚合两种。本实验是用化学聚合。 化学聚合的催化剂通常多采用过硫 酸铵（ AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的 加速剂是 N,N,N',N' -四甲基乙二胺（ TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫 酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔 胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低 pH 时，常会延长聚合时间； 分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以 使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在 1 小时内完成，以便使凝胶 的性质稳定。
1.1.3凝胶浓度和交联度与孔径的关系 凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品 时，常先用
7.5%的标准凝胶或用 4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶 浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂， ；太硬则 脆，也易折断。
1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理 蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电 荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS和
巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷 和形状无关。
在蛋白质溶液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中 的二硫键还原； SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分 子上，形成蛋白质 -SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果： 第一， 使各种蛋白质的 SDS复- 合物都带上相同密度的负电荷， 掩盖了不同种类蛋 白质间原有的电荷差别，使所有的 延时开关电路SDS- 1
蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二， SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质 -SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响， 而只是蛋白质分子量的函数。
选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使
其形成 SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小
的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用 相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。 因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。
1.3染原理
常用的染料主要有氨基黑 程序升温10B、考马斯亮蓝 R250、考马斯亮蓝 G250、 1-苯胺基 -8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝 R250，它的染 灵敏度比氨基黑高 5 倍，尤其适用于 SDS电泳微量蛋白质染。
2试剂与器材
2.1试剂
2.1.1（1 号液）凝胶贮备液
丙烯酰胺（ Acr） 29.2 g
甲叉双丙烯酰胺（ Bis） 0.8 g
加蒸馏水至 100 mL
2.1.2（2号液）浓缩胶缓冲液 （ 0.5mol ／L Tris-HCl 缓冲液， pH 6.8） 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） 6ggtem小室
加蒸馏水约 50 mL，溶解后以 6mol／ L HCl调到 pH 6.8， 定容至 100 mL
2.1.3（3 号液）分离胶缓冲液 （1.5 mol／L Tris-HCl 缓冲液， pH 8.8） 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） 18.15 g
低温脱硝催化剂>氢氧化钙生产
溶解后以 6mol ／ L HCl调到 pH 8.8
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