Grain Science And Technology And Economy
2021 年12月第46卷 第6期
Dec. 2021Vol.46, No.6
我国粮食产量连续7年保持在6.5亿t 以上，实现粮食生产十八年连续丰收[1]。在粮食数量安全得到保障的前提下，粮食质量安全越来越受到重视，消费者对安全、健康、营养粮食产品的诉求益加强烈。近年来，受天气等环境影响，真菌毒素成为威胁我国粮食质量安全的主要因素。据不完全统计[2]，我国每年因真菌毒素污染造成的粮食损失累计超过3 000万t。
真菌毒素是真菌在生长过程中产生的次级代谢产物[3]。致癌性是真菌毒素的主要危害，其中以黄曲霉毒素B 1（aflatoxin B 1，AFB 1）致癌性最强，被国际癌症研究所列为Ι级致癌物[4]。鉴于AFB 1的剧毒性和普遍性，早在2002年，国家质检总局规定小麦粉、玉米、食用油、酱油、醋5类食品实行“市场准入制度”，必须检验AFB 1的含量[5]。近年，相关部门多次修订真菌毒素限量标准，严格监管。 AFB 1的检测方法主要有免疫亲和层析液相谱法、液相谱-质谱联用法、酶联免疫法、胶体金法等。免疫亲和层析液相谱法是测定真菌毒素使用最为普遍的方法之一，但其操作周期较长，需要用到的有 机试剂较多、耗材较贵；液相谱-质谱联用法所需设备更为昂贵，酶联免疫法和胶体金法易受基质干扰，容易出现假阳性或假阴性[6]。时间分辨荧光免疫层析法是近年发展较快的一种检测技
术，具有灵敏度高、检测速度快、结果稳定等优点，已在食品检测行业得到应用[7]。本文拟对该方法在稻谷、玉米等粮食样品检测中的应用进行研究，以期为其进一步推广使用提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
SW-2型时间分辨荧光免疫层析定量检测仪、AFB 1时间分辨荧光免疫层析定量检测卡：江苏省苏微微生物研究有限公司；AL204-IC 型电子天平： 梅特勒-托利多国际股份有限公司；3310型盘式实验粉碎磨：波通瑞华科学仪器有限公司；Multi Reax 型旋涡混匀器：德国Heidolph 公司；MINI-7K 型微型离心机：杭州米欧仪器有限公司；Milli-Q 型超纯水仪：美国密理博公司；20～200 μL 和100～1 000 μL 单道可调移液器：德国Eppendorf 公司。
甲醇（谱纯）、乙腈（谱纯）：德国Merck 公司；AFB 1免疫亲和柱、样品稀释液：江苏省苏微微生物有限公司；玉米全粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质[GBW（E）100386]、花生油中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质[GBW（E）100604]、糙米粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质[GBW （
E）100607]及黄曲霉毒素B 1标准品[GBW（E）100302]：国家粮食和物资储备局科学研究院。1.2 试验方法1.2.1 样品前处理
准确称取2.00 g 粉碎样品（稻谷样品需垄谷）于50 mL 离心管中，加入20 mL 70%甲醇水至离心管中，涡旋提取2 min，高速离心5 min，取上清液。
时间分辨荧光免疫层析法测定粮食中的黄曲霉毒素B 1
张少波1，邓常继2，张海涛3，朱启思1
（1.广东省粮食和物资储备保障中心，广东 广州 510050；2.广东省粮食科学研究所，广东 广州 510050；
3. 江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏 无锡 214000）
收稿日期：2021-11-22
基金项目：第三批全国粮食行业技能拔尖人才工作室项目。作者简介：张少波，男，本科，工程师，研究方向为粮油检测及加工。通信作者：朱启思，男，硕士，高级工程师，研究方向为粮油检测
及加工。
摘要：采用时间分辨荧光免疫层析试纸条及配套的荧光定量分析仪，对粮食中黄曲霉毒素B 1的快速检测
进行了研究。结果表明，该方法的检出限为0.8 μg/kg，定量限为2.6 μg/kg，不同水平的加标回收率在94%～108%。选取标准质控样品进行测试，液相谱法检测结果与该方法结果基本一致。该方法准确可靠，操作简便，适用于粮食中黄曲霉毒素B 1的快速检测。
关键词：时间分辨荧光免疫层析法；黄曲霉毒素B 1；粮食
中图分类号：TS210.7 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste431252ts.20210618
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1.2.2 样品检测
测试前，将未开封的检测卡及试剂平衡至25 ℃。将检测卡平放，用移液器定量吸取100 μL 上清液加入900 μL 样本稀释液中，反复吸打5次以充分混匀，后再吸出100 μL 此混合液垂直滴加于加样孔中，室温下反应10 min 后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检测仪中检测；在仪器感应区中放置对应的标准曲线智能卡，在主界面的“测量”菜单中点击读取智能卡后，点击“样品测量”进行检测仪器读数完成后会自动计算出被检样本中的AFB 1含量，可选择储存及打印结果。1.2.3 检测方法的评价
（1） 定量曲线：将AFB 1的标准品，用50%甲醇水定容配制成1 000 ng/mL 的标准储备溶液；采用0.4%的吐温-PBS（pH 7.2，0.01 moL/L）稀释成0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 ng/mL 的标准工作溶液。分别取100 μL 加至层析卡的样品孔中，每个浓度设置3个平行，由低浓度到高浓度进行检测，时间分辨荧光仪检测T 线荧光强度与C 线荧光强度，计算T/C 值。
（2） 检出限与定量限：取20个阴性稻谷样品，用AFB 1荧光定量试纸条对其进行检测。检出限
（LOD）等于20次测定结果的均值（x -）加上3倍的标准标准差（s ），即x - + 3s ；定量限（LOQ）等于x - + 10 s 。（3） 准确度：按照1.2.1的前处理方法，
在阴性稻谷样品中分别加入10、20、60 μg/kg 的AFB 1标准溶液，测定方法的加标回收率。
P =
c 2 - c 1
c 3
× 100% （1）
式中：P 为加标回收率，%；c 1为阴性稻谷测
定值，μg/kg；c 2为加标稻谷测定值，μg/kg；c 3为加标量，μg/kg。
（4） 精密度：分别选择低、中、高3种浓度的AFB 1标准工作溶液，采用不同批次的测试卡，10次重复试验，计算批间和批内变异系数（CV）。
CV = SD ——MN × 100% （2）式中：CV 为变异系数，%；SD 为标准偏差， ng/mL；MN 为平均值，ng/mL。
（5） 与国标仲裁法的对比试验：取不同基质不同浓度的AFB 1标准物质，先用国标仲裁法——免疫亲和层析液相谱法测定，再使用时间分辨
荧光免疫层析法测定，进行对比验证。
2 结果与讨论
2.1 定量曲线
搪瓷缸对系列标准工作溶液进行测试，以标准工作溶液浓度的自然对数值（In C ）为横坐标，各浓度标准液的T /C 值与0 ng /mL 标准液的T 0/C 0值的比值所得百分比为纵坐标，得到一条平滑的S 曲线，如图1
所示。
T /C 与T 0/C 0的百分比/%
浓度的自然对数（ln C ）
图1 不同浓度AFB 1标准工作溶液的平滑曲线由图1可以发现，在0.01～1.0 ng/mL 浓度范围内，存在一段接近于直线的曲线，其线性方程为y = -15.704x + 23.702，相关系数R 2 = 0.994 8。由此，选定AFB 1标准曲线的线性范围为0.01～1.0 ng/mL，并以AFB 1浓度为横坐标，对应的T/C 值为纵坐标，建立定量曲线，结果如图2
所示。
X 值
Y 值
图2 AFB 1（0.01～1.0 ng/mL）定量曲线2.2 检出限和定量限
由表1可知，本方法的检出限和定量限分别为0.8、2.6 μg/kg，优于GB 5009.22—2016第四法酶联免疫吸附筛查法（方法检出限为1 μg/kg，定量限为3 μg/kg）和LS/T 6111—2015胶体金定量检测法（方法检测限为2 μg/kg），满足GB 2761—2017规定的粮食样品AFB 1的限量要求。2.3 准确度
对阴性稻谷样品进行3水平6平行加标回收率试验，结果如表2所示。由表2可知，本方法加标回收率在94%～108%，相对标准偏差在10%以内，满足检验的要求。
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2.4 精密度
分别选择0.025、0.1、1 ng/mL 3种浓度的AFB 1标准工作溶液，按照1.2.2的检测方法，采用不同批次的测试卡重复试验10次，结果见表3。由表3可知，批内CV 值在7.44%～9.43%，小于10%；批间CV 值在11.90%～14.65%，小于15%，说明该方法均一性良好。 2.5 与国标仲裁法的对比试验
分别采用液相谱法和时间分辨荧光免疫层析法检测玉米全粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质、糙米粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质、花生油中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质，结果如表4所示。由表4可知，在不同的粮食基质中，时间分辨荧光免疫层析法检测值与液相谱法检测
表4 对比试验结果 μg/kg
样品名称
标准值检测值
免疫亲和层析液相谱法
时间分辨荧光免疫层析法
玉米全粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质27±326.928.0糙米粉中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质10.3±1.4 9.8 9.7花生油中黄曲霉毒素B 1成分分析标准物质
15.6±1.6
15.1
16.0
表3 精密度试验结果（n =10）
AFB 1浓度/(ng·mL -1)
批内
批间
平均浓度±标准偏差/(ng·mL -1)
CV/%平均浓度±标准偏差/(ng·mL -1)
CV/% 0.0250.025±0.0029.430.025±0.00313.47 0.10.120±0.0119.240.110±0.01714.651
1.22±0.09
7.44
1.38±0.16
11.90
表1 方法的检出限和定量限
样品次数平均值/(μg·kg -1)
标准偏差/(μg·kg -1)
检出限/(μg·kg -1)
布鲁加达综合征
定量限/(μg·kg -1)
稻谷
20
0.097
0.246
0.8
沙滩棒球2.6
表2 加标回收率试验结果
加标浓度/(μg·kg -1)
测定浓度/(μg·kg -1)加标回收率/
%
相对标准偏差/
细胞分离培养
%
1010.81088.262019.0 958.5060
56.3
94
7.10
（下转第110页）
值较为一致，均在所测标准物质的标准值内。3 结 论
本文对时间分辨荧光免疫层析法在粮食样品的黄曲霉毒素B 1检测进行了研究。该方法的检出限为0.8 μg/kg，定量限为2.6 μg/kg，线性范围为0.1～1 ng/mL，不同水平的加标回收率在94%～108%，批内与批间变异系数（CV）分别在7.44%～9.43%、11.90%～14.65%，均小于15%。选取不同基质的标准质控样品进行测试，本方法与液相谱法检测结果基本一致，在所测标准质控样品的标准值范围内。上述结果说明，本方法的准确度和精密度满足使用要求，且具有简便、快速、经济等特点，适用
于玉米、稻谷等粮食的黄曲霉毒素B 1快速检测。
参 考 文 献
金属表面镜面处理[1] 我国全年粮食产量将再创新高 粮食生产实现十八年连丰[EB/OL].(2021-11-01)[2021-11-20]. h.ttp://v/ 2021/11/01/ARTINEZgNLui74CXYKeN9y6H211101.shtml.[2] 王文珺，叶金，孙双燕，等.粮食污染物的快速检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报,2018,9(21):5552-5558.[3] 陈晓飞.抗玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B 1抗体的制备和评价[D].长春：吉林大学,2014.
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Enzymatic Modification of Pumpkin Seed Protein and Its Functional Properties
Lu Chen, Zhang Yushen, Tong Wenjun, Hu Zhenyang, Du Lihui
（ School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics / Jiangsu Provincial Center for Synergy Innovation in Modern Grain Circulation and Safety/Jiangsu University Key Laboratory of
Grain and Oil Quality and Safety Control and Deep Processing, Nanjing, Jiangsu 210023 ）
Abstract: Pumpkin seed protein was modified by trypsin in order to further develop pumpkin seed protein and improve its emulsifying properties. The protein emulsion was prepared by high pressure homogenization of
enzymolysis protein and soybean oil and its stability was studied. The effects of enzymatic hydrolysis on the protein were observed by measuring solubility, molecular weight, hydrophobicity and emulsifying properties. The effects of the hydrolysate on the stability of the emulsion were investigated by emulsion index, particle size distribution and interfacial protein concentration. The results showed that trypsin improved the solubility, hydrophobicity and emulsifying activity of pumpkin seed protein. The size of protein emulsion droplets after enzymatic hydrolysis was smaller and distributed evenly, and the concentration of interfacial protein increased significantly. Especially,
the stability of protein emulsion with a hydrolysis degree of 5% was the best. The modified pumpkin seed protein is a good natural emulsifier.
Key words: pumpkin seed protein , enzymatic modification, emulsion, stability
41(1): 80-85.以车代磨
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Detection of AFB 1 in Grain by the Time-resolved Fluoro-immunoassay
Zhang Shaobo 1, Deng Changji 2, Zhang Haitao 3, Zhu Qisi 1
（ 1. Guangdong Provincial Food and Strategic Reserves Assurance Center, Guangzhou, Guangdong 510050; 2. Guangdong Institute for Cereal Science Research, Guangzhou, Guangdong
510050; 3. Jiangsu SUWEI
Microbiology Research Co., LTD, Wuxi, Jiangsu 214000 ）
Abstract: This research used time-resolved fluoro-immunoassay strip and assorted time-resolved fluoro-immunoassay portable quick tester to detect aflatoxin B 1 in grain. The assay showed that the limit of determination
and the limit of quantification were 0.8 and 2.6 μg/kg, respectively. The recoveries of samples at different levels were rang between 94% to 108%. The results of the standard quality control sample had a good agreement with those of HPLC. This method was accurate, sensitive and convenient. It is suitable for the rapid screening of AFB 1 in grain samples.
Key words: time-resolved fluoro-immunoassay, aflatoxin B 1, grain
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（上接第82页）
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