实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。导电布双面胶指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：
（一） 抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）
2用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）瓷管电阻器梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
3用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二） 洗涤
1取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
2加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。甩掉其中液体，吸水纸上拍干。 3共洗涤3次。
4用纯水再洗两次。
（三） 封闭
1用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
2洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
3保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
4封闭之后无需洗涤。
（四） 一抗孵育
1封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
2加入一抗100 ul/孔。
3孵育：37℃，1h。
（五） 洗涤
（六） 二抗孵育
1用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
2洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
3孵育：37℃，45 min。
（七） 洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）
（八） 底物显
1配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mg OPD（3-4粒），迅速混匀。待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
2洗涤后加入底物液显，100 ul/孔。
3室温避光反应5-10 min。
终止条件：目测阳性抗体孔已依次出现黄，Blank孔尚无颜时即可加入终止液。led日光管
4预热酶标仪5 min。TMB显用450 nm检测，OPD显用492 nm检测。
（九） 加入终止液
加入终止液（20%稀硫酸）50 ul/孔。
（十） 酶标仪检测A492（Tecan公司，型号Sunrise）
加入终止液5 min内，上机检测。超过5 min检测有误差。
ELISA反应中试剂配方：
10×PBS配制：100 ml
NaCl……………………………………8 g
KCl ……………………………………0.2 g
Na2HPO4▪12H2O………………………3.58 g
KH2PO4 ………………………………0.24 g
加入超纯水80 ml，充分溶解，HCl调节pH 7.2-7.4，超纯水定容至100 ml，过滤后4℃存放。 包被液：1000 ml
NaHCO3………………………………2.93 g
Na2CO3……………………………… 1.59 g
加入500 ml超纯水，调节pH值为9.6；补足超纯水至1000 ml。4℃存放待用。
洗涤液：500 ml
10×PBS ………………………………50 ml
超纯水…………………………………450 ml
Tween 20………………………………0.25 ml
封闭液：100 ml（现用现配）
10×PBS………………………………10 ml
FBS（胎牛血清）…………………… 5 ml
超纯水…………………………………85 ml
Tween20………………………………0.1 ml
样品稀释液：100 ml
10×PBS………………………………10 ml
超纯水…………………………………90 ml
1×甲乙液： 100 ml（甲、乙液分别提前配好，临用前再取所需量混合）
甲液： 柠檬酸……………………………1.92 g
超纯水溶解，定容至100 ml。分闸脱扣器
乙液： Na2HPOrbd5064▪12H柯式烫画2O…………………7.17 g
超纯水溶解，定容至100 ml。
滤过除菌，4℃存放待用。
临用前，取甲液4.86 ml与乙液5.14 ml混合，加OPD 4 mg（有毒，戴手套,4粒），待充分溶解后加入30%H2O250 ul，混匀即可。
甲液2.47ml 乙液2.53ml 水 5ml 4粒OPD 50ul过氧化氢
终止液：100 ml
浓硫酸……………………………………20 ml
缓慢加入80 ml超纯水中，边加边搅拌。
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