化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的检测方法 （征求意见稿）
1 适用范围
本方法规定了采用液相谱-串联质谱法测定化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的方法。
本方法适用于水剂类、香波类、膏霜类和散粉类化妆品中替硝唑（CAS：19387-91-8）、4-硝基咪唑（CAS：3034-38-6）、2-甲硝咪唑（CAS：88054-22-2）、羟基甲硝唑（CAS：4812-40-2）、甲硝唑（CAS：443-48-1）、二甲硝咪唑（CAS：551-92-8）、特尼哒唑（CAS：1077-93-6）、氯甲硝咪唑（CAS：4897-25-0）、苯硝咪唑（CAS：94-52-0）、塞克硝唑（CAS：3366-95-8）、羟基异丙硝唑（CAS：35175-14-5）、奥硝唑（CAS：16773-42-5）、异丙硝唑（CAS：14885-29-1闪蒸温度）、羟基二甲硝咪唑（CAS：936-05-0）、洛硝哒唑（CAS：7681-76-7）等15种禁用硝基咪唑类抗生素的含量测定。本方法中各化合物的检出限、定量下限及取0.5g样品时的检出浓度及最低定量浓度见表1。
表1 15种硝基咪唑抗生素的检出限、定量下限、检出浓度及最低定量浓度
化合物名称 | 检出限 /（ng/mL） | 定量下限 /（ng/mL） | 检出浓度 /（μg/g） | 最低定量浓度 /（μg/g） |
4-硝基咪唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
2-甲硝咪唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
羟基甲硝唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
羟基二甲硝咪唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
甲硝唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
二甲硝咪唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
洛硝哒唑 | 0.75 | 1.5 | 0.05沥青透水混凝土 | 0.1 |
特尼哒唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
氯甲硝咪唑 | 0.75 | 1.5 | 0.05 | 0.1 |
苯硝咪唑 | 0.75 | 1.5 | 0.05 | 0.1 |
塞克硝唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
替硝唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
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（续表）
化合物名称 | 检出限 /（ng/mL） | 定量下限 /（ng/mL） | 检出浓度 /（μg/g） | 最低定量浓度 /（μg/g） |
羟基异丙硝唑 | 0.75 | 1.5 | 0.05 | 0.1 |
奥硝唑 | 0.25 | 0.5 | 0.02 | 0.04 |
异丙硝唑 | 0.1 | 0.2 | 0.005 | 0.01 |
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2 方法提要
化妆品样品经过超声提取、高速离心及固相萃取后，用高效液相谱-串联四极杆质谱进行检测分析。与平行操作的甲硝唑等15种禁用硝基咪唑的标准品进行比较，以保留时间和优化的监控离子对进行定性，以其中信噪比较高、峰形好及背景干扰小的离子为定量离子进行定量，然后以标准曲线进行外标法定量。 3 试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级用水。
3.1 甲醇，谱纯。
3.2 乙腈，谱纯。
3.3 乙醇，分析纯。
3.4 甲酸，谱纯。
3.5 4-硝基咪唑，纯度≥97%。
3.6 2-甲硝咪唑，纯度≥99%。
3.7 羟基甲硝唑，纯度≥99%。
3.8 羟基二甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.9 甲硝唑，纯度≥99%。
3.10 二甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.11 洛硝哒唑，纯度≥99%。
3.12 特尼哒唑，纯度≥99%。
3.13 氯甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.14 苯硝咪唑，纯度≥98%。
3.15 塞克硝唑，纯度≥99%。
3.16 替硝唑，纯度≥99%。
3.17 羟基异丙硝唑，纯度≥99%。
化妆品柜台3.18 奥硝唑，纯度≥98%。
3.19 异丙硝唑，纯度≥99%。
3.20 空白化妆品样品：被检测不含目标化合物成分的化妆品。
3.21 固相萃取柱：Oasis HLB，6 cc，500 mg。
3.22 15种硝基咪唑类抗生素的标准储备溶液：准确称取10 mg（精确至0.0001 g）硝基咪唑抗生素标准品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释种刻度，混匀，得到每种硝基咪唑浓度为1000 μg/mL的标准储备液。
3.23 15种硝基咪唑类抗生素的混合标准储备液：分别精密量取每种硝基咪唑抗生素的标准储备液（3.21）各5 mL 置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀，得到50 μg/mL 的硝基咪唑类抗生素混合标准储备液。
3.24 15种硝基咪唑类抗生素的标准工作液：精密量取一定体积的混合标准储备液（3.22）置于10 mL 容量瓶中，用 10 % 甲醇/水稀释至刻度，使得各硝基咪唑抗生素的浓度分别为0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L、2000 μg/L、5000 μg/L。
4 仪器和设备
4.1 液相谱-串联四极杆质谱仪。
4.2 分析天平：感量为0.001 g。
4.3 分析天平：感量为0.0001 g。
4.4 超纯水器。
4.5 涡旋振荡器。
4.6 精密移液器。
4.7 超声波清洗机。
4.8 通风柜。
4.9 旋转蒸发仪。
4.10 氮吹仪：配有加热装置。
4.11离心机：离心速率可达5000 rpm。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
水剂类化妆品：称取0.5 g（精确至0.001 g）水剂类样品，置于10 mL 比管中，加入25% 甲醇/水溶液，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30 min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50 mL 离心管中，以5000 r/min 离心10 min，取3 mL上清液过Oasis HLB（6 cc，500 mg）固相萃取柱（预先用5 mL 甲醇活化，5 mL 水平衡），先用4 mL 20% 甲醇/水淋洗，然后用8 mL 90% 甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3 mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.45 μm 微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。 香波类化妆品：称取0.5 g（精确至0.001 g）香波类样品，置于10 mL 比管中，加入25% 甲醇/水溶液，涡旋振荡使得香波中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30 min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50 mL 离心管中，以5000 r/min 离心10 min，取3 mL上清液过Oasis HLB（6 cc，500 mg）固相萃取柱（预先用5 mL 甲醇活化，5 mL 水平衡），先用4 mL 20% 甲醇/水淋洗，然后用8 mL 90% 甲醇电容触摸按键/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3 mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.45 μm 微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
膏霜类化妆品：称取0.5 g（精确至0.001 g）膏霜类样品，置于10 mL 比管中，加入25% 甲醇/水溶液，涡旋振荡使得膏霜中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30 min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50 mL 离心管中，以5000 r/min 离心10 min，取3 mL上清液过Oasis HLB（6 cc，500 mg）固相萃取柱（预先用5 mL 甲醇活化，5 mL 水平衡），先用4 mL 20% 甲醇/水淋洗，然后用8 mL 90% 甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3 mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.45 μm 微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
散粉类化妆品：称取0.5 g（精确至0.001 g）散粉类样品，置于10 mL 比管中，加入50% 甲醇/水溶液，涡旋振荡使得散粉中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30 min，冷却至室温后，用50%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50 mL 离心管中，以5000 r/min 离心10 min，取3 mL上清液过Oasis HLB（6 cc，500 mg）固相萃取柱（预先用5mL 甲醇活化，5 mL 水平衡），先用4 mL 20% 甲醇/水淋洗，然后用8mL 90% 甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3 mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.45 μm 微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
5.2 液相谱/质谱参考条件
5.2.1 谱参考条件
谱柱：C18谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；
流动相：乙腈（A）和 0.1% 甲酸-水（B）；
梯度洗脱程序见表 2；
表 2 梯度洗脱条件
Time（min） | Flow（mL/min） | A（%） | B（%） |
0.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
2.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
17.00 | 0.25 | 35.0 | 65.0 |
19.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
20.00 | 电子离合器 0.25 | 95.0 | 5.0 |
20.10 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
22.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
| | | |
注：对于梯度洗脱条件，操作者可根据实际样品的不同而选择最佳谱分离条件，使得禁用硝基咪唑类成分与其他组分峰获得分离。
柱温：30℃；
进样量：5 μL。
5.2.2 质谱参考条件
毛细管电压：3.0 kV；
萃取电压：3.0 V；
射频透镜电压：0.1 V；
离子源温度：150 ℃；
脱溶剂气温度：400 ℃；
脱溶剂气流量：800 L/hr；
锥孔气流量：50 L/hr；
碰撞室压力：3.2×10-3 mbar；
低质量端1分辨率：3.0；
高质量端1分辨率：15.0；
离子能量1：0.5 V；
碰撞室入口电压：1 V；
碰撞室出口电压：1V；
低质量端2分辨率：3.0；
高质量端2分辨率：15.0；
离子能量2：0.5 V；
碰撞气体：氩气；
数据采集模式：MRM（多反应监测）。
0～2.5 min：不进入质谱仪分析，2.5～15 min：进入质谱仪分析。
15种硝基咪唑类抗生素的质谱参数见表3。15种硝基咪唑类抗生素的MRM谱图见图1。
表3 15种禁用硝基咪唑类抗生素的质谱相关参数
化合物名称 | 电离 方式 | 监控离子对（m/z） | 锥孔电压（V） | 碰撞能量（eV） | 保留时间（min） |
4-硝基咪唑 | ESI+ | 114.2/68.2* | 25 | 15 | 2.94 |
114.2/84.2 | 12 |
2-甲硝唑 | ESI+ | 128.2/82.1* | 20 | 15 | 3.97 |
128.2/111.1 | 15 |
羟基甲硝唑 | ESI+ | 188.2/123.2* | 20 互动教学系统 | 15 | 4.18 |
188.2/126.2 | 14 |
羟基二甲硝咪唑 | ESI+ | 158.2/140.2* | 20 | 15 | 5.24 |
158.2/55.2 | 15 |
甲硝唑 | ESI+ | 172.2/128.2 | 20 | 15 | 5.43 |
172.2/82.1* | 20 |
二甲硝咪唑 | ESI+ | 142.2/96.2* | 25 | 15 | 6.26 |
142.2/81.2 | 20 |
洛硝哒唑 | ESI+ | 201.2/140.2* | 15 | 12 | 6.50 |
201.2/55.2 | 20 |
特呢哒唑 | ESI+ | 186.2/128.2 | 20 | 15 | 7.05 |
186.2/82.2* | 25 |
氯甲硝咪唑 | ESI+ | 162.2/116.1* | 25 | 17 | 8.38 |
162.2/145.1 | 15 |
苯硝咪唑 | ESI+ | 164.2/118.2* | 30 | 18 | 8.11 |
164.2/91.1 | 30 |
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