血管紧张素 II 通过细胞外信号调节激酶1／2通路调控过氧化氢酶的表达及促进成纤维细胞表型转化 定时药盒
沈凯;陈芬;林卓明;陈士良;袁国裕;刘晓光
【摘 要】目的：探讨细胞外信号调节激酶1/2（ ERK1/2）在高血压大鼠模型动脉外膜血管重塑中的作用。方法：利用血管紧张素II （ Ang II）微泵灌注制备高血压大鼠模型，随机分为未处理组、生理盐水灌注组和Ang II灌注组。分别检测各组大鼠尾动脉收缩压及血管形态学改变；Western blotting技术检测外膜成纤维细胞过氧化氢酶（ CAT）蛋白在未处理组、单纯Ang II、ERK1/2抑制剂PD98059和Ang II＋PD98059培养下的表达。结果：大鼠颈动脉HE染和收缩压结果显示，与未处理组及生理盐水灌注组相比，Ang II组大鼠颈动脉中膜厚度和收缩压明显增加（P＜0.01），动脉形态结构有明显改变，并且有显著的病理性血管重塑发生。 Western blotting 检测结果显示， PD98059作用下CAT比单纯Ang II明显增高（P＜0.05），表明ERK1/2信号通路能够恢复Ang II诱导的CAT表达下调。结论：Ang II可能通过ERK1/2信号通路下调血管外膜CAT的表达，进而促进血管细胞表型转化，导致血管病理性重塑发生。%AIM:To explore the effect of extracellular signal-regulated kinase 1/2 ( ERK1/2) o n the vascular adventitial remodeling in a hypertension rat model .METHODS:The rats were randomly divided into control group , mini-pump infusion of saline group and mini-pump infusion of angiotensin II ( Ang II) group as the hypertension model .The sys-tolic pressure and vascular morphology of the rats were examined .Adventitial fibroblasts were treated with Ang II , PD98059 ( ERK1/2 inhibitor) and Ang II+PD98059.The catalase ( CAT) expression in the cells was detected by Western blotting . RESULTS:Compared with control group and mini-pump infusion of saline group , the systolic pressure and carotid media thickness (stained by HE) in mini-pump infusion of Ang II group were significantly increased (P<0.01).Meanwhile, ar-tery morphology in mini-pump infusion of Ang II group had obviously changed with a significant occurrence of pathological vascular remodeling .The result of Western blotting showed that the expression of CAT in the adventitial fibroblasts treated with Ang II+PD98059 was much higher than that in the cells treated with Ang II alone (P<0.05), indicating that down-regulation of CAT induced by Ang II was restored by ERK 1/2 signaling pathway .CONCLUSION:Ang II down-regulates CAT through ERK1/2 pathway and promotes cell phenotype transformation , which lead to pathological vascular remodeling .
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】4页(P711-714)
【关键词】血管紧张素II;ERK1/2通路;过氧化氢酶;表型转化
【作 者】沈凯;陈芬;林卓明;陈士良;袁国裕;刘晓光
【作者单位】温州医科大学附属舟山医院 心血管内科，浙江舟山316004;温州医科大学附属舟山医院 细胞分子生物学实验室，浙江舟山316004;温州医科大学附属舟山医院 细胞分子生物学实验室，浙江舟山316004;温州医科大学附属舟山医院 心血管内科，浙江舟山316004;温州医科大学附属舟山医院 心血管内科，浙江舟山316004;温州医科大学附属舟山医院 细胞分子生物学实验室，浙江舟山316004
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【正文语种】中 文
【中图分类】R329.21
血管重塑是指血管内径和血管壁厚度的适应性变化，是高血压病显著病理特征和并发症产生的主要原因[1]。研究发现病理状态下血管外膜可产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，通过自分泌、旁分泌作用参与血管重塑发生。而过氧化氢酶(catalase, CAT)在清除ROS中发挥重要作用，病理情况下，CAT表达和活性受到抑制，机体的氧化-抗氧化系统的平衡遭到破坏，大量ROS蓄积就导致病理性血管重塑[2]。
血管紧张素II (angiotensin II, Ang II)是引起高血压性血管重塑的重要介质，研究表明细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2, ERK1/2)信号通路在Ang II诱导的氧化应激反应中发挥着重要作用，通过下调血管成纤维细胞内CAT的表达和活性，导致H2O2大量蓄积、细胞发生表型转化[3-4]。本文通过对大鼠高血压模型的研究显示Ang II通过ERK1/2通路调节CAT表达，从而在高血压大鼠模型动脉外膜成纤维细胞表型转化中发挥了作用，为高血压血管重塑的防治提供新的理论依据。
材 料 和 方 法
1 材料
1.1 主要试剂和材料 150～200 g清洁级SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。Alzet微泵(型号2002)。血管紧张素Ⅱ、CAT抗体(鼠来源)和α-actin抗体购自Sigma。ERK1/2抑制剂PD98059购自碧云天公司。DMEM高糖培养基及胎牛血清购自Gibco。小动物无创尾动脉血压测量仪(Softron BP98A)。
1.2 动物分组 SD大鼠150～200 g 18只，随机分为3组，每组6只，分为未处理组(对照组)、Ang II灌注组(500 ng·kg-1·min-1)和生理盐水对照组。
2 主要方法
2.1 动物模型制备 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，背部埋入预置AngⅡ或生理盐水的微量泵，逐次缝合皮下及皮肤。连续灌注14 d，分别在0、3、7和14 d利用Softron BP98A 尾动脉血压测量仪测定安静状态下的大鼠尾动脉收缩压。每次测量至少5次，取平均值。
2.2 细胞培养 处死大鼠后，取胸主动脉，放入盛有DMEM 的培养皿中。仔细分离血管周围结缔组织，纵向剖开血管。在另一培养皿中放少量培养液，仔细分离内膜、中膜和外膜。
在另一培养皿中滴加1滴胎牛血清，将外膜剪成大约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块。添加含20%胎牛血清的 DMEM 培养液，放置 5% CO2、37 ℃培养箱培养。5～7 d后细胞 80%～90%融合时用0.25%胰蛋白酶消化，传代。取4～7代用于实验。分别用4种方法进行培养:(1) 不特殊处理培养24 h；(2) 单纯Ang II(10-7mmol/L)培养24 h；(3) PD98059(10-5mmol/L)培养24 h；(4)Ang II+PD98059(10-5 mmol/L)培养24 h。
2.3 血管形态学检测 在Ang II灌注后14 d行4%多聚甲醛灌注，取颈动脉常规固定、石蜡包埋制备石蜡切片。之后分别行HE染检测血管形态学改变。建筑钢模
2.4 Western blotting 培养的血管外膜成纤维细胞按上述分组后干预24 h，提取细胞总蛋白后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。5%脱脂牛奶封闭2 h，Ⅰ抗(CAT：1∶1 000；β-actin：1∶5 000) 4 ℃孵育过夜，第2天复温后加HRP标记的Ⅱ抗孵育1 h，之后用ECL发光液显影。利用Gelpro32软件进行定量分析。
3 统计学处理
数据用SPSS 16.0软件包分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间两两比较用单因素方差分析检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
背光片1 各组大鼠尾动脉收缩压变化情况
分别于Ang II灌注之前及灌注后3 d、7 d、14 d测量大鼠尾动脉血压。在灌注之前，各实验组大鼠的尾动脉收缩压无显著差异。灌注3 d后Ang II灌注组其尾动脉收缩压水平持续升高，而对照组及生理盐水组收缩压未有明显改变，Ang II灌注组与其余2组相比，差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01)，见表1。
表1 各组大鼠的血压变化情况Table 1. The change of blood pressure in each group(mmHg.Mean±SD.n=6)*P<0.05,**P<0.01 vs control group at the same time point. Group0 d3 d7 d14 dControl101.2±9.8104.2±12.1102.4±11.3104.3±10.5Saline99.2±10.8101.6±10.2104.7±12.8103.2±11.5Ang II102.3±9.8125.2±13.4∗154.3±11.2∗∗161.7±12.6∗∗
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2 SD大鼠颈动脉形态学变化情况
在灌注14 d后用HE染检测各组大鼠颈动脉中膜厚度。Ang II灌注后能够使颈动脉中膜厚
度显著增厚，与对照组及生理盐水组相比差异有统计学意义(P<0.01),见图1。这表明Ang II能够显著促进血管重塑的发生。
Figure 1. HE staining of carotid and determination of media thickness (×100). A: control group; B: saline group; C: Ang II group.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs control.图1 颈动脉HE染及中膜厚度测定
3 Ang II通过ERK1/2通路调控CAT表达及促进表型转化
4种方法培养外膜成纤维细胞24 h后用Western blotting检测CAT，发现单纯Ang II培养中外膜成纤维细胞CAT蛋白明显高于未特殊处理的对照培养组(P<0.05)。给予ERK1/2信号抑制剂PD98059后，外膜成纤维细胞CAT蛋白明显高于单纯Ang II培养(图2)，同时也降低了α-actin的表达(图3)，这表明Ang II通过ERK1/2信号通路下调抗氧化酶CAT的表达，进而促进成纤维细胞的表型转化。
讨 论
既往关于血管重塑的研究主要集中于血管内膜的内皮细胞和中膜的血管平滑肌细胞，却忽
略了血管外膜改变在重塑形成中的作用，但越来越多的研究证明血管外膜在各种血管重塑过程中发挥着重要作用[5]，Schulze-Bauer等[6]在研究人类血管外膜的力学特征时发现血管外膜对血管的塑形起重要作用。血管外膜受到损伤等因素刺激时能够释放多种血管活性物质(IL-6、MCP-1等)刺激细胞增殖、迁移等病理变化[7]。
Figure 2. The expression of CAT was regulated by Ang II through ERK1/2 pathway.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Ang II.图2 Ang II通过ERK1/2调控CAT表达
Figure 3. The expression of α-actin was regulated by Ang II through ERK1/2 pathway.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs Ang II.图3 Ang II 通过ERK1/2调控α-actin表达
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