网络出版时间：２０２０－６－５１４：０８ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０２００６０４．１０２６．０２２．ｈｔｍｌ
饶江燕１，李明航２，刁俊玲２，王 松２，赵 攀２，张兴渝２，刘海林２
（１．重庆医科大学药学院生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 ４０００１６；
２．重庆两江新区第一人民医院药剂科，重庆 ４０１１２１）
收稿日期：２０２０－０３－０９，修回日期：２０２０－０４－１４
基金项目：重庆市科学委员会资助项目（ＮｏＣＳＴＣ２０１９ｊｓｃｘ
ｍｓｘｍＸ００９６
）作者简介：饶江燕（１９９６－），女，硕士生，研究方向：神经药理学，Ｅ
ｍａｉｌ：１１０７６０８５０４＠ｑｑ．ｃｏｍ
刘海林（１９８７－），男，博士生，主管药师，研究方向：神经药理学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：７１９２０４８９９＠ｑｑ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２０．０７．０１１
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２０）０７－０９４０－０６中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３２９ ２４；Ｒ７４３ ３１；Ｒ９７７ ６
摘要：目的 探讨贝沙罗汀（Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）对脑缺血／再灌注（ｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｉ／Ｒ）损伤的保护作用及对线粒体自噬的影响。方法 将Ｃ５７ＢＬ／６雄性小鼠随机分为假手术组（Ｓｈａｍ）、模型组（Ｉ／Ｒ）、药物组（Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ），运用线栓法构建小鼠中动脉栓塞（
ｔｒａｎｓｉｅｎｔｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ｔＭＣＡＯ）模型。术前连续５ｄ，每日一次腹腔注射给药。术后２４ｈ对脑梗死体积及神经功能进行评价；ＨＥ染观察海马神经元病理改变；免疫荧光染及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测自噬相关蛋白Ｌ
Ｃ３、Ｐ６２及线粒体膜蛋白ＴＯＭ２０表达；透射电镜观察线粒体形态变化；检测线粒体ＡＴＰ含量及膜电位水平评估各组线粒体功能。结果 与Ｉ／Ｒ组相比，Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ干预后可明显
改善ｔＭＣＡＯ小鼠神经行为学的评分，有效阻止ｔＭ ＣＡＯ后脑组织形态学的改变，降低脑梗死体积，下调ｔＭＣＡＯ小鼠脑组织Ｐ６２、ＴＯＭ２０表达，上调ＬＣ３的表达，增加损伤部位自噬小体，维持了更好的线粒体功能。结论 贝沙罗汀通过适度上调线粒体自噬，及时清除脑Ｉ／Ｒ后受损线粒体，减轻小鼠脑损伤。
关键词：贝沙罗汀；脑缺血／再灌注损伤；神经保护；线粒体自噬；ＬＣ３；ＭＭＰ
近年来，伴随着社会人口老年化加剧，脑卒中在我国的发病率逐年攀升，已成为最主要的致死、致残
性疾病，给社会、家庭带来沉重的负担［１］
。然而目
前还没有一个公认的神经保护作用的药物可在临床上有效改善脑卒中结局。因此，继续寻有效缺血性脑卒中的药物具有重要研究价值及临床意义。
自噬作为一种细胞的生物学过程，具有抑制炎症因子的产生，降低氧自由基，抑制细胞凋亡，并能为细胞器的更新提供原料的功能。在维持细胞内稳
态，保证机体健康状态扮演重要角［２－３］
。线粒体
自噬发生在线粒体中，其可选择性清除受损及功能障碍线粒体，目前有关线粒体自噬在脑缺血／再灌注损伤（ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ，Ｉ／Ｒ）中作用的研究较多，但其在脑Ｉ
／Ｒ过程中扮演的确切角仍存在较大争议［４］。因此，进一步探究并开发作用于线
塑料染粒体自噬相关靶点的药物对脑Ｉ／Ｒ的防治意义重大。
贝沙罗汀（Ｂｅｘｒｏｔｅｎｅ）是一种ＦＤＡ批准用于皮肤淋巴瘤的药物，其具有较小的分子量，较高的
脂溶性，易透过血脑屏障等优点［５］。近年来的研究
证实，其可通抑制抗炎、凋亡等途径对多种神经系统
疾病有保护作用［６］。Ｈｕｕｓｋｏｎｅｎ等［７］报道了Ｂｅｘａｒ
ｏｔｅｎｅ能通过调节自噬，改善滔蛋白病变小鼠脑缺血／再灌注损伤后的神经行为学评分及脑梗死
体积，但其对线粒体自噬的研究尚未见报道。本研究通过中动脉栓塞（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕ ｓｉｏｎ，ｔＭＣＡＯ）模型，使用药物Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ干预后观察小鼠行为学评分，脑梗死体积，损伤部位组织学、线粒体功能变化以及自噬相关蛋白表达情况，探讨Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ对脑缺血／再灌注损伤的保护作用以及其对线粒体自噬的影响。１ 材料
１．１ 实验动物 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，♂，体质量（２０～２５）ｇ，ＳＰＦ级，购买于重庆医科大学实验动物中心，许可证号：ＳＹＸＫ渝２０１８ ０００３。
１．２ 试剂 ＡＴＰ检测试剂盒（Ｓ００２６）、线粒体膜电位检测试剂盒（ＪＣ １）（Ｃ２００６）、组织线粒体分离试剂盒（Ｃ３６０６）、蛋白印迹相关试剂，均购于ＢｅｙｏｔｉｍｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；２，３，５ 氯化三苯基四氮唑（２，３，５ ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴＴＣ），购于Ｓｉｇｍａ公司；抗体ｐ６２（５１１４Ｓ），ＬＣ３Ｂ（３８６８Ｓ），ＴＯＭ２０（＃４２４０６），均购自于ＣＳＴ公司；β ａｃｔｉｎ（６０００８ １ ｌｇ），ＴＯＭ２０（６６７７７ １ １ｇ），购于Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ
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公司。
１．３ 仪器 －８０℃超低温冰箱（美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ）；低温离心机（美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；多功能酶标仪（美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；湿式转膜仪、垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（美国Ｂｉｏ Ｒｉｄ公司）；正置显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ公司，Ｅ ＣＬＩＰＳＥ５０ｉ）；透射电镜（ＨＩＴＡＣＨＩ公司），倒置显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ）。
２ 方法
２．１ 小鼠Ｉ／Ｒ模型的建立 ♂Ｃ５７小鼠，通过ｔＭ ＣＡＯ建立小鼠Ｉ／Ｒ模型，过程如下，首先用１％异钠麻醉小鼠后将其仰卧固定，颈部备皮，７５％酒精消毒局部皮肤，颈中线切口２ｃｍ，分离颈前肌，右侧胸锁乳突肌，显微镜下仔细分离右颈总动脉（ｃｏｍｍｏｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙ，ＣＣＡ），颈内动脉（ｉｎｔｅｒｎａｌｃａ ｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙ，ＩＣＡ）和颈外动脉（ｅｘｔｅｒｎａｌｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙ，ＥＣＡ），结扎颈总和颈外，暂时夹闭颈内，随后在颈总靠近心脏一端剪一“Ｖ”型小口将线栓通过ＣＣＡ残端插入ＩＣＡ，有阻力感
带阻火器的呼吸阀
时停止插入，并活结固定线栓。缺血１ｈ后，拔出线栓，缝合伤口，开始再灌注过程（２４ｈ），假手术组的小鼠除不插入线栓外，其余操作均相同。手术过程中使用恒温红外灯将小鼠体温维持在（３７±０ ５）℃。快速厌氧胶
２．２ 分组与给药 ６０只小鼠随机分为假手术组（ｓｈａｍ），模型组（Ｉ／Ｒ组），药物组（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ），每组２０只。２０ｍｇｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ先用ＤＭＳＯ溶解。聚乙二醇（１，５） 羟基硬脂酸镁、乙醇、水以１５∶１０∶７５的比例配制的混合液作为溶剂稀释。除假手术组外，药物组术前每天腹腔注射上述配置好的ｂｅｘａｒｏ ｔｅｎｅ（５ｍｇ·ｋｇ－１），于第５次给药１ｈ后建立Ｉ／Ｒ模型。模型组则仅给予等量的溶剂（除不含药物外，其余成分均相同）。
２．３ 神经功能评分 再灌注结束后，参照改良的Ｌｏｎｇａ五步四分评分法对小鼠的神经功能进行评分［８］。评分值越高，神经行为功能损害越严重。２．４ ＴＴＣ染评估脑梗死程度 再灌注结束后，小鼠在深度麻醉下断头取脑，首先置于－２０℃冰箱中３０ｍｉｎ，取出后置冰面，弃去嗅球部分，做冠状切片。随后放入装有２％ＴＴＣ染液的培养皿中，锡箔纸包裹避光，置于有提前３７℃水浴预热双面染２０ｍｉｎ。染结束后后置于４％多聚甲醛中固定４℃后冰箱过夜。置于深背景面观察，红为正常脑组织，白为梗死后脑组织。
２．５ ＨＥ染 再灌注２４ｈ后，小鼠深度麻醉后固定，先后使用ＰＢＳ及４％多聚甲醛经心脏灌注，取脑后置于４％多聚甲醛溶液中固定３６ｈ。石蜡包埋后切片，行ＨＥ染。不同光学显微镜下观察损伤部位海马神经元细胞完整性，细胞核有无固缩等情况。２．６ 组织线粒体的提取 组织线粒体的提取参照试剂盒说明书进行，步骤如下：取ＰＢＳ清洗后的新鲜损伤侧海马脑组织与培养皿中，剪碎后，加入０ １ｍｇ·μＬ－１的线粒体分离试剂Ａ。研磨后收集匀浆液，（６００）×ｇ，４℃离心１０ｍｉｎ，收集上清液后再次（１１０００）×ｇ，４℃离心１０ｍｉｎ。沉淀即为线粒体，收集沉淀（线粒体），置于－８０℃保存备用。
２．７ 透射电镜观察线粒体自噬的现象 再灌注结束后，小鼠深度麻醉后固定，断头取脑，分离出损伤侧海马组织，冰面上制备成１ｍｍ３大小的组织块，迅速置于４℃的戊二醛溶液中固定。送至电镜室后处理并采集图片。
２．８ 免疫荧光染 再灌注２４ｈ后，小鼠深度麻醉后固定，先后使用ＰＢＳ及４％多聚甲醛经心脏灌注，结束后取脑并将其由前向后做冠状冰冻切片（５μｍ厚）备后续用。在４℃下采用１∶１００稀释的兔来源的ＬＣ３，ＴＯＭ２０多克隆抗体（ＣＳＴ，１∶２５０）对冰冻切片组织进行孵育。过夜后，在３７℃下，采用荧光二抗在避光条件下对切片组织进行孵育１ｈ，使用荧光显微镜对切片拍照。
２．９ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测损伤侧海马线粒体自噬相关蛋白及线粒体膜蛋白表达 再灌注结束后，深度麻醉下断头取脑，收集各组小鼠的损伤侧海马组织，将组织在液氮中研碎后提取总蛋白，总蛋白浓度采用ＢＣＡ法测定。上样量每孔３０μｇ，经过ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶电泳，转膜，室温５％ＢＳＡ封闭２ｈ，一抗４℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育并洗膜后显成像。成像结果用Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ检测图像灰度值并分析结果，以目标蛋白与β ａｃｔｉｎ灰度值的比值表示蛋白的表达水平。
２．１０ ＡＴＰ含量的测定 参照ＡＴＰ检测试剂盒说明书，进行以下操作：首先将新鲜的缺血侧海马组织按照每２０ｍｇ组织加入约１００～２００μＬ裂解液的比例加入裂解液中，然后用玻璃匀浆器匀浆裂解。充分裂解后４℃１２０００×ｇ离心５ｍｉｎ，取上清，用于后续的测定。在３７℃下将ＡＴＰ试剂添加到微孔中５ｍｉｎ，然后添加样品或者标准品并混合１０ｓ，最后用多功能酶标仪进行测量。绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出每组ＡＴＰ的含量。
２．１１ 线粒体膜电位（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏ ｔｅｎｔｉａｌ，ＭＭＰ）检测 ＭＭＰ检测参照试剂盒说明书进行，步骤如下：按说明书要求配制好ＪＣ １染工
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作液和缓冲液。０ ９ｍＬ稀释后的ＪＣ １染工作液中加入０ １ｍＬ总蛋白量为１０～１００μｇ纯化的线粒体，多功能酶标仪进行检测，检测单体（绿）最大激发波长为５１４ｎｍ，最大发射波长为５２９ｎｍ；检测ＪＣ １聚合物（红）最大激发波长为５８５ｎｍ，最大发射波长为５９０ｎｍ，ＭＭＰ＝（红／绿）％。
２．１２ 统计学处理 所有实验数据以珋ｘ±ｓ形式表示。所有数据均使用ＳＰＳＳ２０版本软件进行分析，神经行为学评分采用Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ分析，其余指标各组间比较采用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）。３ 结果
３．１ Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理减轻了Ｉ／Ｒ诱导的脑损伤 ＴＴＣ染和行为学评分结果显示，与Ｉ／Ｒ组相比，Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处可以明显减少Ｉ／Ｒ小鼠损伤侧脑梗死体积（Ｆｉ
ｇ１Ａ、１Ｂ）且降低明显改善神经功能缺损评分（Ｆｉｇ１Ｃ）。
３．２ Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理减少了Ｉ／Ｒ诱导的缺血区组织细胞的死亡 ＨＥ染结果显示，Ｉ／Ｒ组小鼠损伤侧海马区神经元排列混乱，细胞核缩小且染加深，有较多的死亡细胞。Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ组中细胞排列比较整齐，且可以见到清晰的核仁，只有少量细胞死
亡（Ｆｉｇ２）。
３．３ Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理上调了Ｉ／Ｒ小鼠的线粒体自噬水平 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证明，与Ｉ／Ｒ组相比Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可明显上调自噬相关蛋白ＬＣ３Ｂ，同时线粒体膜蛋白Ｔ
ＯＭ２０和Ｐ６２表达水平降低（Ｆｉｇ３Ａ Ｄ）。组织荧光结果显示得到的结果与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果一致，即Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可明显上调缺血侧海马区ＬＣ３Ｂ的表达，下调ＴＯＭ２０的表达（Ｆｉｇ３Ｅ Ｇ）。另外，透射电镜结果显示，与Ｉ／Ｒ组相比，
Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ组双层膜结构的自噬小体明显增多（Ｆｉｇ３Ｈ）。这些结果揭示Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可增加Ｉ／Ｒ小鼠的线粒体自噬水平。
３．４ Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可以改善Ｉ／Ｒ小鼠的线粒体功能 Ａ
ＴＰ含量和ＭＭＰ结果显示，与Ｉ／Ｒ组相比，Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ组ＡＴＰ含量和ＭＭＰ都明显增高（Ｆｉｇ４Ａ、４Ｂ）。由此说明Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ可以改善Ｉ／Ｒ诱导的线粒体的损伤。４ 讨论
目前有关线粒体自噬在脑缺血／再灌注损伤中作用的研究较多，但其在缺血／再灌注损伤过程中扮
演的确切角仍存在较大争议。Ｂａｅｋ等［９］
管式直线电机
研究认
Ｆｉｇ１ ＢｒａｉｎｄａｍａｇｅｉｎＩ／Ｒｍｉｃｅｒｅｄｕｃｅｄｂｙｂｅｘａｒｏｔｅｎｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ａ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｐｉｃｔｕｒｅｏｆＴＴＣｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｂ：ＴｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｉａｇｒａｍｏｆＡ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）；Ｃ：Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｅｔｏｅｖａｌｕａｔｅｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｆｉｃｉｔｓ（珋ｘ±
ｓ，ｎ＝１０）．
Ｐ＜０ ０１ｖｓＩ／Ｒ．
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２４９·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２０Ｊｕｌ；３６（７）
Ｆｉｇ２ ＤａｍａｇｅｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｔｉｓｓｕｅｃｅｌｌｓｏｆＩ／Ｒｍｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙｂｅｘａｒｏｔｅｎｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４） Ｐ＜０ ０１ｖｓＩ／
奥沙利
Ｒ
Ｆｉｇ３ ＭｉｔｏｐｈａｇｙｉｎＩ／Ｒｍｉｃｅｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｂｅｘａｒｏｔｅｎｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ａ～Ｂ：Ｐ６２，ＴＯＭ２０，ＬＣ３Ｂｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄｄｉａｇｒａｍａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｉｏ；Ｃ～Ｄ：ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＬＣ３ＢａｎｄＴＯＭ２０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉｃｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆＩ／Ｒｍｉｃｅ（ｓｃａｌｅｂａｒ＝５０μｍ，ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ４００×）．ＴｈｅｔｏｐｒｏｗｓｈｏｗｓＴＯＭ２０（ｒｅｄ），ｔｈｅｍｉｄｄｌｅｒｏｗｓｈｏｗｓＬＣ３Ｂ（ｇｒｅｅｎ）ａｎｄｔｈｅｂｏｔｔｏｍｒ
ｏｗｓｈｏｗｓｔｈｅｍｅｒｇｅｄｉｍａｇｅ．Ｅ：ＴＥＭｉｍａｇｅ（ｓｃａｌｅｂａｒ：５００ｎｍ），ｂｌｕｅａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅｎｏｒｍａｌｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｎｄ
ｒｅｄａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＩ／Ｒ
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３４９·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２０Ｊｕｌ；３６（７）
Ｆｉｇ４ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎ
Ｉ／Ｒｍｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙｂｅｘａｒｏｔｅｎｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ａ：ＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐ；Ｂ：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＩ／Ｒ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＳｈａｍ
为，肌肽可通过下调自噬信号而改善线粒体功能，减轻脑缺血／再灌注损伤。Ｚｈａｎｇ等［１０］
研究表明，自噬在脑缺血阶段发挥有害作用，而在再灌注阶段通过激活线粒体自噬而发挥保护作用。而Ｙｕａｎ等［１１］研究认为，上调线粒体自噬，能通过及时清除受损线粒体而产生对脑缺血／再灌注损伤的保护作用，这与Ｌｉ等［１２］的研究结果一致。因此进一步探究线粒体自噬与脑缺血／再灌注损伤的关系，将为缺血性脑损伤的提供重要依据。
Ｂｅｘｒｏｔｅｎｅ为选择性的视黄酸Ｘ受体激动剂，近年来研究显示，其具有抗炎，调节自噬，抗氧化应激等作用，在帕金森病，创伤性脑病，蛛网膜下腔出血等中枢神经系统疾病中的保护作用被广泛报道［６］。Ｍａｒｔíｎ等［１３］认为神经元细胞中线粒体的代谢和结构异常在ＡＤ病理生理中起着至关重要的作用，应用Ｂｅｘｒｏｔｅｎｅ干预后，可以上调线粒体自噬，及时清除受损线粒体也是对ＡＤ模型保护作用的重要机制。本研究首次在脑Ｉ／Ｒ模型中探索本Ｂｅｘｒｏｔｅｎｅ保护作用的新机制，研究中发现，与模型组相比，ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可明显改善Ｉ／Ｒ损伤组小鼠的神经功能缺损，减少脑梗死体积及降低缺血区组织细胞的坏死，上调线粒体自噬标记蛋白表达，提高线粒体ＭＭＰ和ＡＴＰ水平，因此ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ的神经保护作用与其改善线粒体功能有关。
自噬标记蛋白ＬＣ３主要包括存在于细胞质里面的ＬＣ３Ｉ和存在以自噬小体膜上的ＬＣ３ＩＩ两种形式组成，两者可相互转化，其中ＬＣ３ＩＩ常被认为是自噬形成的标志分子。Ｐ６２可充当支架蛋白的形式与ＬＣ３相结合，进而被溶酶体酶降解，当自噬水平降低时，Ｐ６２表达水平通常较高，
反之当自噬水平升高时，表达量通常降低。因此，本研究本实验选取ＬＣ３，Ｐ６２，作为观察自噬发生的关键蛋白。为观察Ｉ／Ｒ及药物干预后线粒体变化情况，我们选取线粒体膜蛋白ＴＯＭ２０表达水平来反应线粒体含量变化［１４］。我们的研究结果发现，同时上调自噬标记蛋白ＬＣ３的表达，而Ｐ６２及ＴＯＭ２０表达水平明显降低。以上结果表明，ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理可有效的激活线粒体自噬，这与电镜观察结果一致。大脑内线粒体含量远高于其他部位，脑Ｉ／Ｒ后因线粒体膜除极化、膜孔蛋白通透性改变等原因，导致了脑缺血部位的线粒体功能障碍［１５］。本研究为验证药物干预后线粒体功能的变化，我们检测了各组线粒体ＡＴＰ含量及线粒体膜电位水平，结果显示ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ预处理后ＡＴＰ含量及膜电位水平较Ｉ／Ｒ组明显升高，有效的改善了线粒体水平。
综上所述，ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ对小鼠脑组织Ｉ／Ｒ损伤有保护作用，其可能机制与上调线粒体自噬，及时清除受损线粒体，同时为合成新的线粒体提供原料，确保细胞内线粒体质量有关。本研究为进一步寻脑Ｉ／Ｒ损伤中线粒体自噬相关靶点的药物提供新思路。
参考文献：怎么自制纳米胶带
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［４］ ＫｉｒｋｉｎＶ，ＭｃＥｗａｎＤＧ，ＮｏｖａｋＩ，ｅｔａｌ．Ａｒｏｌｅｆｏｒｕｂｉｑｕｉｔｉｎｉｎｓｅ
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