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前列腺干细胞抗原及其单链抗体-碱性磷酸酶
尚国富22，刘江丽、，于欢、，唐开义22，曾柱222，胡祖权122，王$、,
摘要扩增前列腺干细胞抗原（PSCA）及其特异单链抗体PaFv的编码基因，分别克隆到pETV-v和pDAP6/S载体中，转化大肠杆菌感受态细胞。融合蛋白T/A-PSCA和PaFe-AP诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析其表达情况，碱性磷酸酶（AP）显反应和ELISA检测蛋白的活性。结果显示构建的原核表达体系成功实现TrxA-PSCA和PaFe-DP 融合蛋白的可溶性表达，而且PaFv-AP具有与PSCA抗原结合的抗体活性以及AP活性。 关键词前列腺干细胞抗原；单链抗体；碱性磷酸酶；原核表达；免疫学检测
中图分类号R392.2；Q786
文献标志码A文章编号1000-1492（2020）12-1968-05 doi：10.19405/j.c/bi.issnl400-1496.0020.17.034
前列腺癌是男性常见的癌症，也是男性癌症死亡三大原因之一4］。前列腺癌的患病率在我国呈现迅速上升的趋势，该癌症成为危害我国男性健康的重要疾病⑵。因此，建立快速、有效的前列腺癌检测技术体系，对于临床诊断和具有重要作用。前列腺干细胞抗原（p/state stem cell antigen, PSCA）是一种糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白，在前列腺组织中的表达有很高的特异性，其表达水平在前列腺癌组织中显著高于正常前列腺组织9］。因此,PSCA被认为是诊断和预后前列腺癌的生物标志物，也是的理想靶点l8-3。该研究分别构
2226-9-03接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：81662253）；贵州省科学技术基金（编号：黔科合支撑［2016］0727号、黔科合基础［221］
1410、黔科合平台人才［2710］5676）；国家级大学生创新
创业训练项目（编号：221196926）
作者单位：贵州医科大学、生物与医学工程重点实验室/贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心、7基础医学院/生物与工程学
院、1环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室，
贵阳55925
作者简介：尚国富，男，硕士研究生；
王赞，女，副教授，硕士生导师，责任作者,E-mail：soo
gy/n@gmc.eUu.1
胡祖权，男，教授，博士生导师，责任作者,E-mail：U uzu-
quan@gmc.eUu.1建PSCA以及抗PSCA单链抗体（sing-e-laiv vokv-bie fraymext,scFv）与碱性磷酸酶（alkaFne phosphatase,AP）融合蛋白的原核表达体系，大量表达并检测其活性，为后期发展基于融合蛋白的免疫检测技术提供实验支持。
1材料与方法
11实验材料大肠杆菌B—1（DE3）、大肠杆菌XL2BUe、4ETA2a载体及pDAP6/S载体由华中农业大学分子生物技术实验室馈赠。pETA6n载体含有TrxA基因,PSCA基因构建到该载体中可诱导表达重组TmA-PSCA融合蛋白，pDAP2/S载体含有AP基因,PaFv基因构建到该载体中可诱导表达重组PaFv-AP融合蛋白。T4DNA连接酶、Tap聚合酶、RNAase、DNA Marker购自日本Tabara公司; T/pdbe、Yeast
轻钢结构雨棚extract购自英国Oxoid公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司; BCIL/NBT显试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白Marker购自美国Thedio-Bisher公司；抗HR单克隆抗体、AP标记羊抗小鼠特异抗体、对硝基苯磷酸二钠（pNPP）购自美国Sigma-AUkl公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2PCR引物根据NCBI数据库中的PSCA基因序列，利用Pk/er Pk/er5.0软件设计扩增PSCA 成熟肽序列的引物，引物（表2由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1本研究引物序列表
引物名称序列(5,05)
PHU/ATTAATTCGGATCCCTGCTGTGCTACTCCTG
PHUP
TGGTGCCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGT
GGGCATGGGCCCCGCTGGCGT
TF ACGACGACAAGGCCATGGC
T2-GCTAGTTATTGCTCAGCGG
pDA/9-Syei TTTCAAGGAGACAGTCATAAT
pDA/9-Sap GTTAAACGGCGAGCA
1.3PSC4基因的扩增和RrFv基因的合成培养
前列腺癌细胞，采用TRNoi法提取细胞总RNA，采用Oliav(dT)6D5引物反转录合成cDNA，再利用特异引物PHRF/PHisB进行PCR扩增获得PSCA基因。在50p i反应体系中，分别加入9p i cDNA、PHis/、PHRB和dNTPs,5pi6x PCR Buffer,0.7pl Tap酶;PCR扩增反应条件为：69C预处理9min；64C4mid,55C4mid,72C、89s,30个循环;52 C、19mib o取9pl PCR产物通过1.2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测。
为了提高抗PSCA单链抗体PaFa的原核表达效率，根据大肠杆菌的遗传密码偏爱性，利用GeokmaU Codon Optisiza/on工具优化PaFe的密码子，由金斯瑞生物科技公司合成，同时在基因的5'端添加SS限制酶酶切位点，在3'端同时添加9U 连接肽和Nol限制酶酶切位点。
13基因克隆与阳性克隆鉴定用BamHI和Xhof 分别酶切PSCA目的基因和pET-34a载体，通过琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，再在T4DNA连接酶的作用下将目的基因连入载体中，获得可用于原核表达的pET信号检测器
W9a-LSCA重组载体。经热激法转化至大肠杆菌BL1(DE3)感受态细胞中，涂布于含有Amp (60p g/ml)的LB培养板上,37C培养6h。挑取单克隆培养并利用载体特异引物TF/T5-进行PCR 扩增检测，根据DNA条带大小鉴定阳性克隆，送公司测序验证。
用SS和NotP内切酶分别切割pDAP9/5载体的质粒DNA和PaFe目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，再在T4DNA连接酶的作用下将目的基因连入载体中获得可用于原核表达的pDAP2/S-PaFa重组载体。经热激法转化至XL1-Baue大肠杆菌感受态细胞中涂布于含有Amp(100 p g/ml)的LB培养板上,37C培养6h o挑取单克隆培养并利用载体特异引物pDAP9-SceUgDAP2-Sap进行PCR扩增鉴定，阳性克隆送公司测序验证。13TrxA-PSCA融合蛋白的原核表达与纯化取22pl甘油保存的重组菌株BL1(DE3)/gETW4a-PSCA接种于29ml含60p g/ml Amp的2TY液体培养基4]中,37C、290r/min振荡过夜培养后，取6ml菌液接种至890ml含120p g/ml Amp的2TY 培养基中,37C、24r/min振荡培养使其OD60/nm达到0.4~0.6时，加入终浓度为0.7mmoUF的异丙基-/-D-硫代半乳糖苷(isodvpyl/-D-thSgaUcPside, ITTG)，继续诱导表达9h o超声波破碎提取TvA-PSCA融合蛋白，在4C条件下8006r/min离心9mn取菌液上清液利用Nn2NTA基质纯化。纯化后的TvA-LSCA融合蛋白经BCA定量试剂盒定量后，取4p g上样进行SDS-/AGE检测。
1.3PaFe-AP融合蛋白的原核表达取29p i甘油保存的XL1-Blpe/gDAP9/S-PaFa重组菌液，接种于29ml含有60p g/ml Amp的2TY液体培养基中，于37C恒温摇床290r/min培养12h。取6ml 菌液转接到290ml
排火
新鲜的含有60p g/ml Amp的2TY培养基中，于37C恒温摇床290r/min培养使其OD64"i达到0.5~0.6时，加入终浓度为0.5 mmoUF的ITTG诱导蛋白表达。在29C条件下290V min诱导培养12h o4C、5000Umin离心6 mis收集菌体，加入U ml PBS缓冲液重悬菌体4]，经超声波破碎处理后，4C、6000r/min离心6 mn收集上清液。
1.7Westerv blot分析取20p i XLl-BUe/ pDAP2/S-PaFa重组大肠杆菌大量表达的总蛋白经6%SDS-/AGE电泳后，利用半干转印仪将凝胶中的蛋白转印到NC膜上，放入5%脱脂奶粉溶液中封闭9h后，再用1:940稀释的抗HR单克隆抗体室温孵育9h,AP标记的二抗室温孵育9h，最后用BCIT/NBT显试剂显。
1.3AP显反应及ELISA检测PaFe-AP融合蛋白的活性原核表达的PaFa-NP融合蛋白通过AP 显反应快速检测融合蛋白的AP活性4]，再通过ELISA反应检测融合蛋白的抗原结合特性。用PBS 稀释TvA-LSCA蛋白至29ng/p i，取U0p i加入ELISA板孔中,37C孵育9—PBS作为空白对照。加入290p i PBS洗板3次后，每孔加入290p i9%(W/ V)BSA溶液,37C封闭9h o甩干ELISA板中的封闭液，每孔加入290p i PBS洗板3次。随后，每孔加入UO p i表达的PaFa-NP融合蛋白(29ng/p i),37 C孵育20h o用290p i PBST和PBS分别洗涤3次后，加入U0pl0.2%(W/V)pNPP显液，黑暗条件下反应后用酶标仪在449nm波长下测定OD值。
13统计学处理采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，计量数据用x±s表示。两组之间比较运用独立样本i检验，以P<0.49为差异有统计学意义。
2结果
2.1目的基因的获取以cDNA为模板，利用特异引物通过PCR扩增获得PSCA目的基因，凝胶电泳检测显示目的片段约250bp(图1A)，与预期的大
小一致。另外，根据大肠杆菌的遗传密码子的使用频率，优化抗PSCA单链抗体的编码基因，并添加内切酶酶切位点和218连接肽，合成Paav基因片段，凝胶电泳检测结果如图1B所示，目的基因片段与预期的约850by相一致。
A bp 1000750500250100-
B bp
2000
一叶荻750
500
250
M PaFv
1000
图1PSCA基因及PaFv基因的电泳图
A；PSCA基因；B：单链抗体编码基因P cl O v；M：DNA Marbos；1、2：PSCA的PCR产物
2.2原核表达载体的构建重组载体pETA-u-PSCA转化大肠杆菌B—1（DE3）后，随机挑取5个单克隆转化子,PCR扩增结果显示5号克隆扩增出的DNA条带大小与预期一致（图6A）。公司测序结果确证PSCA基因成功构建到pETA6n载体中。重组载体pDAP6/S-PaFa转化大肠杆菌XLl-Plue后，PCR扩增结果显示23号克隆扩增出的DNA条带清晰明亮（图2B）。测序结果确证成功获得含有pDAP2/S-PaFa重组质粒的阳性转化子。
A bp 1000
750
500250-
B bp
2000
1000
750
500
c型变压器
250
M12345图2PCR鉴定阳性转化子
A:pETV2a-TSCA转化子的鉴定；B：pDAP6/S-TaFa转化子的鉴定；M：DNA Marker-5：5个转化子的PCR产物
2・3蛋白的原核表达与检测重组菌株B—1（DE3）/pETA2oPSCA在37C、260dmP条件下，0.5mmol/L ILTG诱导表达56纯化后获得的T/A-PSCA融合蛋白浓度为0.44ma/mi。SDS-PAGE电泳检测结果如图3A所示，在约28ku处出现单一的目的条带，获得了纯度约35%的可溶性T/A-PSCA融合蛋白。
含有pDAP2/S-PaFa重组质粒的大肠杆菌通过ILTG诱导表达，超声波破碎处理提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳和Wuhd杂交检测。结果显示有单一的约97ku大小的蛋白条带（图3B），与PaFv-AP融合蛋白的分子量相一致。2.4PaFv-AP融合蛋白的活性分析AP显反应显示原核表达的PaFv-AP融合蛋白能够快速催化pNPP底物显，其显值高于对照组，差异有统计学意义4=-67.945,PV0.91）（图4）。实验组
ku M1ku M1
130HP*
100
70->
55-or
40-■“
图3TrxA-PSCA和PaFv-AP融合蛋白的表达鉴定M：蛋白Marker,Al:TmA-TSCA融合蛋白;B1：PaFv-AP融合蛋白
图4AP显反应和ELISA检测PaFv-AP融合蛋白的活性
平均读值为对照组9.2倍，说明融合蛋白可溶性表达并具有很强的AP活性。在ELISA孔中包被T/A-PSCA重组蛋白，加入原核表达的PaFv-AP融合蛋白进行ELISA检测（图4）,PaFv-AP融合蛋白的0。45"0值与对照组相比，平均读值相差3-6倍，差异有统计学意义（t=-65.044,P<0.001），表明原核表达的PaFv-AP融合蛋白保留scFv和AP的活性，可用于PSCA蛋白的免疫学检测。
3讨论
PSCA是一种前列腺癌肿瘤相关抗原，由Reiter d h［8］在1095年研究前列腺癌的基因表达过程中发现。近年来的研究宀44］表明PSCA的表达与前列腺癌患者的预后密切相关，可作为前列腺癌预后的指标以及晚期患者的靶标。本研究克隆了人PSCA成熟肽的编码基因序列（78-317Uy），通过与促溶蛋白标签T/A融合表达T/A-PSCA蛋白作为免疫检测的抗原。
免疫学检测方法具备特异性好、灵敏度高、价格低廉和操作简单等优势，现已被广泛应用于疾病诊断及毒素检测分析等［「5］。scFv是通过基因工程技术制备的具有完全抗原结合位点的最小抗体片断，对靶抗原的结合活性与天然抗体十分接近"鳥由于scFv的特殊小分子结构，蛋白糖基化修饰对其活
性功能影响较小，可在大肠杆菌等原核生物中高效表达，纯化过程和操作简单4、]。更重要的是，scFa
基因可根据表达的宿主细胞进行密码子优化来提高表达量、可溶性和活性等，也可在体外进行设计改造或与AP、细胞因子等蛋白质的编码基因通过基因工程操作融合表达，从而改变或增加scFa的特性42-2]。scFa-NP融合蛋白用于抗原检测时不需要添加酶标记二抗，从而使免疫学检测过程大大加速，检测成本显著下降，应用前景十分广泛4]o 本研究确定在ITTG终浓度为0.7mmoUF时, 37C诱导培养9P能够获得大量可溶性表达的TvA-LSCA融合蛋白；在ITTG终浓度为0.0mmoU L时,20C诱导培养12P能够高效可溶性表达PaFa-NP融合蛋白。AP显反应和ELISA分析结果显示原核表达的p a Fa-Np融合蛋白保留了scFv 和AP的活性，但尚未达到检测应用的要求，后续将进一步优化表达条件后通过发酵大量生产融合蛋白，或通过分子建模和定点突变等技术提高融合蛋白的活性。本研究通过基因工程操作技术实现了PSCA抗原和PaFe-AP融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，为后续前列腺癌免疫诊断的应用研究奠定了实验基础。
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(2Immune Celis ani AhPoOy Enyirheriny Researct Cehes of Guizhoo Provincc,Kep Laboratorg of Biolofy ml MePSai Engineering,S c O oo I of Biolofy anl Engineering,2S ctooi of
Basic Medicai Sciences,Guizhoo Medical UnSersPP,Guiyang550029)
Abstryct Tha PSCA goo eucoding pvstatg stem call antigen(PSCA)and PaFv geoa eucoding PSCA-s
pgcific scFv antibody were amplihed and cUned into pETWOa and pDAP2/5vectors；respecFve-y.AUaz indpceU for o-p/ssSn of TvA-LSCA and PaFe-AP fusion proteins,SDS-LAGE and Western blvt woo couducted to cUyza their expression Uveis and forms,whereas alka/na pPospPataso(AP)co/r-reocnou and euzyme-linked immpnosorUeut csay(ELISA)were appUed to detect tha activity of PaFe-AP fusion.Tha results suggested tUat TvA-LSCA and PaFe-AP Uision pvteins were successfully expressed in soluPia Ucm in tha constuicted pvdaryotic expression systems.Moreover,tha PaFe-AP fusion retained tha c/goCinning capacity of antibody and AP activity.
Key W o C s pvstatg stem cell antigen;sing-g-chain vaUab-g fragmevt antibody;alkaCna phosphatase;pvdcyo/c expression;ismunoUghai detectiod
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