DMD基因突变与肌营养不良症严重程度的关系1
申本昌1，张成1，2
（1．中山大学附属第一医院神经科，广州510080
（2．中山大学干细胞与组织工程研究中心）
Email：czym@gzsums.edu
摘要：DMD基因突变引起DMD/BMD型肌营养不良，DMD基因突变包括缺失或重复以及点突变，一般说来，缺失/重复类型的整码突变导致DMD的发生，而不破坏“阅读框”的框内突变则引起BMD，但也有例外情况，外显子跳跃和无义介导的RNA衰减使DMD基因突变与肌营养不良症严重程度的关系变得复杂化，不能仅靠突变的类型来判断肌营养不良症的严重程度。 关键词：DMD/BMD；缺失/重复；外显子跳跃；无义介导的RNA衰减
Duchenne和Becker型肌营养不良(Duchenne/Becker’s muscular dystrophy, DMD／BMD)是X连锁、隐性遗传的神经肌肉系统疾病，DMD（MIM 310200）和BMD（MIM 300376）的发病率分别是大约1／3500和1/18000活产男婴。已证实该基因定位于人类X染体短臂上(Xp21．1-3)（Muntoni et al. 2003）。
该病是由人类DMD基因（300377）突变引起的，DMD基因缺失/重复突变占55%-65%，而点突变占35%左右，一般说来，整码突变导致DMD 的发生，而不破坏“阅读框”的框内突变则引起BMD，但也有例外情况。
DMD基因是当今已知的人类最大的基因，跨越2400 kb，其基因组长度约占人基因组的0.1%，X染体的1.5%，由79个外显子和78个内含子构成，整个基因内含子序列占99%（图1）。DMD基因编码的RNA长达14 000 bp，主要在肌肉组织、心肌组织表达，在大脑组织也有少量表达。这样大的基因座具有较高频率出现的新突变和异位断裂点。有研究报道：约有1／3患者系新的突变引起；在所有突变中，基因缺失占55%～65% ，基因重复占5％～15％，点突变占30%左右[1]。其中缺失为主要突变类型，外显子缺失具有不均一性的特点。
从氨基末端到羧基末端分为四个功能区: 氨基末端的肌动蛋白结合区、三螺旋结构区、半胱氨酸富集区和羧基末端区。肌动蛋白结合区有240个氨基酸残基，三螺旋结构区由2400个氨基酸残基组成，构成了抗肌萎缩蛋白的大部分；此区域的基因在大量突变后仍有弱的表达。第3区包括150个氨基酸残基，因有大量半胱氨酸而被称为半胱氨酸富集区；抗肌萎缩蛋白联结蛋白(DAP)中的β-dystroglycan在此区与抗肌萎缩蛋白结合。羧基末端区由420个氨基酸残基组成，其一级结构类似抗肌萎缩蛋白亲缘
蛋白。syntrophin与抗肌萎缩蛋白在此区结合；由71-74号外显子表达，此区可被选择性地剪接；此区突变严重影响表型，说明该区对抗肌萎缩蛋白的稳定性极为重要[2，3]。
进行性肌营养不良症的病因及发病机制极为复杂，遗传因素即病理基因所引起的一系列酶及生化改变在发病中起主导作用。近年来多数学者认同该病的细胞膜学说，该疾病是由于
肌细胞遗传性某种代谢缺陷使细胞膜即肌纤维结构和功能发生改变。细胞膜上分布着一组骨架蛋白，共同维系着细胞膜的稳定性，称为抗肌萎缩蛋白结合蛋白（dystrophin-associated
1本课题得到卫生部临床重点项目基金（2001321）、高等学校博士学科点专项科研基金（200330558058）、国家自然科学基金项目（30370510）、广东省自然科学基金博士启动项目（5300783及04300353）及中国博士后科学基金（2005037172）的资助。
protein）。包括 dystrophin（抗肌萎缩蛋白）、dystroglycan complex,（DG，肌营养不良蛋白聚糖复合体）、sarcoglycans（肌聚多糖）复合体、syntrophin复合体等。这些蛋白与细胞外基质蛋白（laminin）发生联结（图1）。最近解释dystrophin减少引起肌无力的机制与这些联结的失调有关，最终使肌纤维膜不稳定并导致肌纤维坏死[4]。
图1 Dystrophin蛋白及其相关蛋白相互作用总图
图标标示的是一组蛋白的总称，而非一个单独的分子。图中已标明Dystrophin蛋白的氨基末端和羧基末端，
其中成串的小珠表示蛋白的糖基化
Diagram summering dystrophin and associated protein interactions. Some labels do not name each
molecule individually and only the group names are mentioned. The carboxyl (C) and amino (N) termini of the dystrophin are indicated. The branched beads represent glycosylation of the dystrophin.
2 疾病的严重情况与缺失、重复突变的关系
DMD／BMD是X连锁、隐性遗传的神经肌肉系统疾病，由人类DMD基因突变引起。有研究报道：约有1／3患者系新的突变引起；大部分突变为基因内缺失，在所有突变中，外显子缺失突变占55%～65%，重复突变占5％～15％，点突变占35 %左右（无义突变或引起移码突变、内含子与外显子剪接接头序列突变）。
DMD基因的缺失分布于整个DMD基因，既可累及启动子区域、保守的3′-羧基末端，也可是整个DMD基因的缺失。但存在2个缺失“热区”，分别位于5′-端的2—20号外显子区域（编码第12至第874个氨基酸残基；5′-端缺失的断裂点通常在2号和7号内含子序列内，也有可能在下游内含子序列内）和中央的45—53号外显子区域（编码第2146至第2624个氨基酸残基；断裂点通常在44号内含子序列内），DMD缺失突变存在“热区”是多重PCR检测DMD缺失的遗传学理论基础[5]。
外显子缺失的大小范围与临床上疾病严重情况没有简单的关联。例如，缺失第44号小外显子，通常引起典型的DMD。然而，整个基因缺失50%，病人却是BMD[6]。抗肌萎缩蛋
图2 DMD基因外显子缺失对阅读框的影响（A）正常的DMD阅读框（B）4号外显子缺失导致整码缺失（in-frame deletion）（C）7-11号外显子缺失导致整码缺失（in-frame deletion）（D）7号阅读框缺失导致
移码突变（out-of-frame mutation）
Figure 2. Efffects of different genomic deletions on the reading frame of the dystrophin gene (A). The open reading frame remains intact when removing of exon 4 (B) and exon 7-11 (C), the deletion of exon 7 results in the延时开关电路
loss of the reading frame (D).
白的中央和杆状区似乎是功能方面不可缺少的，和肌痛与肌痉挛密切相关，但与肌无力没有必要关联。部分病人有胞浆中存在肌氨酸激酶的升高现象[7，8]。部分病人的32-44，48-51，或48-53号外显子整码缺失，但抗肌萎缩蛋白浓度正常或基本正常[9]。
缺失范围（或重复）对表型的影响，在很大程度上和缺失（也适合重复突变）的大小没有直接关联。病情严重程度关键取决于这种突变是否会破坏阅读框结构（图3）[10]。另外发现，缺失范围和位置有差别很大的患者，表现型的严重程度却十分接近。其原因可能与无义介导的mRNA衰减（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）现象有关[11]。这种现象可以解释抗肌萎缩蛋白功能拯救失败（loss of rescue of dystrophin function）及不同个体缺失外显子范围相同，但因RNA降解控制的效率的个体差异所所导致的表型变异问题。
保持阅读框完整的突变（整码突变），通常导致不正常、但有部分功能的抗肌萎缩蛋白，患者表现为BMD。而DMD病人，缺失或重复通常破坏了阅读框，产生的不稳定的RNA，截短的抗肌萎缩蛋白在肌肉中很快降解，浓度低到几乎无法检测到的程度（图4）。解释DMD/BMD的阅读框假说可以解释约90%的病例，在肌萎缩病例确认和DMD/BMD的区分方面发挥了应有的作用[10，12，13]。
“阅读框规则”（frameshift rule）可以解释大部分DMD/BMD患者外显子缺失/重复与表型严重程度的关系，但也的确有例外的情况。如按照阅读框规则判断，应没有抗肌萎缩蛋白的患者，却表现为BMD。
对这种现象通常可以解释如下：（1）肌型启动子和/或第一个外显子遭到破坏，使用其他启动子（心肌型启动子除外），进行表型拯救，从而导致心肌受累，而骨骼肌不受影响[14]；（2）在DMD基因5′端上游的缺失，可以在基因缺失下游重新开始蛋白的合成启动，而产生没有正常的5′氨基端、但也是一个完整的蛋白质[15]；（3）阅读框内存在终止密码子或有外显子缺失的DMD基因可通过基因跳跃而产生部分转录子，从而产生缺失部分氨基酸残基的抗肌萎缩蛋白[16，17]。
图3 抗肌萎缩蛋白不同突变的表型效应
图中最上方是全长的抗肌萎缩蛋白。框内缺失导致有部分功能的抗肌萎缩蛋白（中间），而破坏阅读框的缺失则导致不稳定的截断的抗肌萎缩蛋白[18]
Figure 3. effects of different mutations on the dystrophin protein. The complete protein (top). An in-frame deletion of the spectrin-like domain results in a shorter but partial functional protein (middle). An out-of-frame deletion leads to a truncated protein and degraded rapidly in the muscle[18].陶瓷纤维管
3 外显子跳跃现象
整码缺失或重复的BMD患者，其突变通常发生在5′端的3-7号、 5-7号或 3-6号外显子，或更远端下游的51号、49-50号或 44-45号外显子[19，20，21]。这些患者通常借助于差异剪接，以外显子跳跃（exon skipping）的方式产生部分抗肌萎缩蛋白；这些情况下，抗肌萎缩蛋白通常保留有羧基末端。单纯使用分子遗传手段诊断这类病人，往往存在困难，尤其是对那些没有家族史的患儿，仅有部分患儿发展为BMD或DMD。造成表型差异如此巨大的原因，目前尚不完全清楚，可能和外显子跳跃的类型及效率有关，外显子跳跃产生的较长的mRNA，部分保持了阅读框的顺序，因此是有功能的。对于这类病人，可以通过肌肉活检的办法来证实有无抗肌萎缩蛋白的存在，然后结合临床评价，来预测疾病的严重程度。3-7号外显子阅读框外缺失导致的BMD，可能是由于外显子8有一个额外的翻译起始密码子。此假说来自RNA的有关研究，没有发现外显子跳跃现象，而且外显2和外显子8是连在一起的，说
明有阅读框外突变转录子mRNA分子[15]。我们通过检测发现，同样是10-20号外显子缺失突变，患者的表型可能表现为DMD，也可能是症状较轻的BMD（未发表资料）。
对阅读框改变的突变引起外显子跳跃的机制，目前了解很少，可能和多个因素有关。外显子跳跃限于缺少抗肌萎缩蛋白的Mdx鼠的少数纤维和50%的DMD患儿。回复突变纤维（纤维中的突变被抑制，有正常功能的抗肌萎缩蛋白）和DMD诊断相符合。但许多移码突变的病人也产生相当数量的抗肌萎缩蛋白。尽管外显子跳跃发生在一些特定区域的外显子，但这类外显子缺失并不能预计就会产生外显子跳跃。研究发现，缺失44号外显子的13个病人，其中8个病人为DMD患者，4个为BMD患者，一个表型为DMD 和BMD中间类型。45号外显子缺失的病人，7个为DMD，2个为BMD[18]。
影响外显子跳跃的一个可能因素是内含子序列中断裂点的不同。抗肌萎缩蛋白的许多内含子序列很长，这些内含子序列不可避免地存在多种断裂点。外显子缺失相同的病人，很可能存在不同的基因组断裂位点。例如，44号外显子缺失，意味着5′和3′端断裂点分别在43号和44号内含子序列内（270 kb），不同患者的2个内含子内的断裂点可能不同，内含子序列可能含有影响基因剪接的基序（motif）。不同缺失位点，可能会影响外显子跳跃的发生。例如，5号外显子缺失的病人，表型为DMD或BMD，DMD病人有许多环状分子（小的环状RNA分子，由许多重排的外显子组成），而线性分子则是由缺失外显子6和外显子9的
外显子跳跃所产生；而BMD患者，则存在很多缺失外显子5、但属于框内缺失的的转录子，这说明不同的缺失断裂点参与了抗肌萎缩蛋白的复杂剪接调节过程[22]。
影响外显子跳跃的还有其他因素，其中一个证据来自Mdx模型鼠的研究。Mdx鼠的抗肌萎缩蛋白基因的23号外显子，有一个无义突变。外显子跳跃使Mdx鼠能产生抗肌萎缩蛋白，近而产生回复突变纤维（RFs）。Mdx鼠有相同的突变位点和一样的内含子序列组成。但是，许多回复突变纤维却由不同外显子转录、翻译而来，部分回复突变纤维缺失近30个外显子，这说明外显子跳跃和同一条染体上的内含子序列是没有关系的[23]。最近的研究还表明，在外显子跳跃过程中，起作用的还有一些顺式作用因子。根据这个假说，CUG-结合蛋白（通过与抗肌萎缩蛋白的结合而参与剪接调节）表达水平存在个体差异，也可以影响抗肌萎缩蛋白的剪接调节[24]。因为影响抗肌萎缩蛋白表达的因素很多，对没有阳性家族史的DMD/BMD患者的确诊，并不能完全依靠分子遗传学手段，而需要进行肌肉活检以避免误诊。
通过小分子介导的外显子跳跃研究，可以影响抗肌萎缩蛋白基因的剪接，这方面的研究有可能为DMD的提供新的思路。
DMD表型与产生抗肌萎缩蛋白的能力有关，但也有少数例外。5′延伸至中间棒状结构域的大范围缺失就是这种例外，如3-31号外显子缺失，3-25号外显子缺失，4-41号外显子缺失或4-18号外显子缺失。
这和缺失棒状区而不缺少5′的肌动蛋白结合位点的BMD形成了鲜明的对比。棒状区的大范围缺失，只要保留有氨基和羧基末端，通常产生BMD。3-13号外显子框内缺失，破坏了5′肌动蛋白的结合域，通常导致DMD表型的发生，说明了肌动蛋白的结合域是很重要的。
对抗肌萎缩蛋白功能域加深了解，对肌萎缩的诊断十分重要，而且对DMD的基因十分有利。Chamberlain通过研究发现，可以通过不同组合删除抗肌萎缩蛋白的多个区域而产生多种有功能的小-/微-抗肌萎缩蛋白。一些人工蛋白在肌萎缩病人并不存在，但可用于mdx转基因鼠，而且有很好的效果[25]。截短的抗肌萎缩蛋白比全长基因更容易克隆入载体，因而有很大的应用前景。
10.10.0.10通过研究DMD/BMD基因突变类型和肌萎缩严重程度的关系，可以为揭示DMD/BMD 发病的分子机制提供理论基础，有利于临床医师对肌萎缩综合症进行确诊，从而更好地服务于DMD/BMD患者的遗传咨询工作。
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