血卟啉和其衍生物的复合盐，它们的合成及用做剂的制作方法

专利名称

：血卟啉和其衍生物的复合盐，它们的合成及用做剂的制作方法

技术领域

：
本发明涉及血卟啉和其衍生物的复合盐，它们的合成及将它们用做剂。
血卟啉和其衍生物的新盐可用于检测和肿瘤。
近十多年来，血卟啉和其衍生物(HpD)作为光敏剂用于检测和破坏人或动物体中的肿瘤。这些化合物以静脉注射并通过活化转运转落到各种机体器官上。在正常健康组织中它们由于代谢和分泌只停留较短时间，而在肿瘤组织它们则延滞并以不变浓度保留几天时间。这一特征在光动力学方法中用来诊断和选择性破坏肿瘤组织。由于所有血卟啉衍生物微溶于水，因此到目前为止制备它们的水溶液仍是非常困难的。
在Cancer Research”，V.44，P.1924，1984/也可见ibid，V.45，P.635，1985中报道了制备血卟啉注射用制剂的方法。依据该方法，血卟啉衍生物溶于NaOH溶液中，搅拌1小时，用0.1N HCl调节pH至约7.1。但这是很不方便的，因为即使pH稍微过头导致低于pH7.0，都会引起化合物沉淀。最终溶液是通过加适量盐水制备的。将溶液进行灭菌后贮存在密封的安瓿中。由于所有血卟啉衍生物的强聚集倾向，该水溶液是不稳定的。根据该文献，该溶液可保存约3个月稳定性，条件是它们放在暗处于-20℃冷冻保存。
本发明提供了血卟啉和其衍生物的新的水溶性复合盐，其溶液pH为7.2-7.8(依据浓度)，这可快速制成在水或盐水中有良好溶角性的溶液并要使剂具有更好的生物利用度。
出人意料的是，现已发现该新复合盐的活性超过了已知血卟啉和其衍生物的钠盐(HpDNa2)的生物活性。更具体讲，通过对细胞株研究表明该新盐不必照射就可抑制肿瘤细胞的发展。
本发明的血卟啉和其衍生物的盐具有通式1
其中R1和R2可相同或不同，并代表下列基团-CH＝CH2，-CH(OH)-CH3，-CH(OR3)-CH3，其中R3代表可形成含醚和/或酯键的低聚物，它包括衍生于通式2单体的1-5个相同式不同的单元，或R1和R2
本发明也提供了通式1的盐的混合物和这些盐聚集物。符号A的优选氨基酸包括等电点超过7的氨基酸，特别是l-精氨酸，赖氨酸，组氨9酸或羟基赖氨酸。优选的盐包括R1和R2相同且为-CH(R4)-CH3的通式1那些盐和式3醚的盐和式5的盐
优选的混合物包括含血卟啉，原卟啉，乙烯氘卟啉和二血卟啉醚或可能有的它们的聚集物的氨基酸盐的那些混合物。
根据本发明，在合成通式1血卟啉或其衍生物的复合盐或通式1盐的混合物的方法中(通式1中各符号定义如前所述)，将通式4的血卟啉衍
生物或通式4的至少两个衍生物的混合物(其中R1和R2定义如前所述(条件是如果R1和R2代表-CH(R4)-CH3，则R4取代基的羧基可是游离的或被保护)与羧基是游离的或保护的碱性氨基酸或其单盐酸盐反应，该反应最好在有机溶剂，在有机溶剂的混合物中或在含有机溶剂和水的介质中或有机溶剂和水的混合物中进行，可除去保护羧基的基团，产物即通式1的盐或通式1盐混合物(可能含通式1盐的聚集物)被分离出来。
本发明的方法中，氨基酸的氨基与血卟啉衍生物的羧基的反应按下面等式形成离子系统-COOH+H2N-R→-COO-++H3N-R等电点大于7的氨基酸，尤指精氨酸，赖氨本，组氨酸或羟基赖氨酸，被用做碱性氨基酸。
为了保护起始化合物中的羧基，可用各种已知的封端基，例如在“Protective Groups in Organic Synthesis”，T.W.Green，John Wiley and Sons，1981中所述的那些。这些基团举例有烷基，苄基或甲硅烷基酯及用于保护羧基官能团的其它基团。
该反应可在较宽的温度范围进行，优选从室温-100℃，更优选50-70℃。反应时间通常为几分钟至10多小时。
适合的有机溶剂包括酰胺，如甲酰胺，二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺;腈，如乙腈，，异;酯，如乙酸乙酯;酮，如丙酮，亚砜，如二甲基亚砜;醇和碳酸乙酯，或它们的混合物。反应通常在水性有机介质中进行。
封端基团(如存在)可通过已知步骤，如水解或氢解除去。
通式1的盐或其相应混合物可通过不同方法从反应混合物中分离出来，如沉淀，结晶和其它已知方法。特别优选的方法包括加溶剂或低极性溶剂的混合物到反应混合物中，所加溶剂与反应中所用溶剂可按1∶1-1∶5比例形成均匀溶液。适宜的溶剂包括，例如乙醚或丙酮。所得反应混合物放置几分钟至10多小时以便产物慢慢沉淀。过滤分出沉淀，洗涤，真空干燥，干燥剂最好是P2O5。该产物是稳定的并不潮解。它们必须避光保存。分离阶段可包括产物混合物的分离。
式4起始化合物是已知的，其可由氯化血红素制备。
本发明还提供了用于检测和/或肿瘤的剂，其含有通式1的盐或其至少两个盐的混合物和可能的聚集物，其中式中各符号定义如上所述。
该混合物举例有含血卟啉，原卟啉，乙烯氘卟啉，二血卟啉醚的氨基酸盐的混合物，也可能是它们的聚集物。
本发明的剂可含固态式1盐或式1盐的混合物，最好是贮存在无菌密闭容器中。
无菌密闭容器含有有效剂量的式1盐或其混合物。有效剂量通常为1.5-10mg/kg体重。在容器中贮存的盐可被很快制成用于直接非肠道给药的无菌水性溶液。
本发明的剂也可制成备用制剂，在这种情况下，活性成份即式1盐或其混合物与药用稀释剂或载体混合。剂通常通过注射给药，但也可腹膜内或直肠给药。制剂举例有无菌水溶液。水溶液除含式1的盐外，还可能含食盐，如需要，还可含丙二醇。依上所述，这些溶液可在制备后马上应用或保存在无菌容器中。
本发明剂可不必照射应用;但在诊断和肿瘤的光动力学方法中作为光敏剂则更有效。
式1新化合物在细胞株上进行试验。将Lipson等人得到的原卟啉各种新盐和常规使用的HpD新盐制剂(血卟啉衍生物)用于培育48小时的9种不同肿瘤细胞株。所有化合物以水溶液形式使用，所有浓度为50mcg/ml。
检测如下进行1)细胞荧光(F)培育48小时后，洗涤细胞，用荧光显微镜测量荧光密度并用任意的0-4级进行表达;
2)培育48小时后的活细胞百分比(P%);
3)在不同制剂中细胞增殖系数(M)如下表达M＝ (48小时后带有试验制剂(50mcg/ml)的培养皿中的增殖细胞)/(48小时后在对照培养皿中的增殖细胞)该结果见表1，2，3。这些结果表明式1化合物在对各种试验细胞株的亲和力上不同，并显示出对这些细胞存活的不相似作用。当用不同的衍生物时，可选择对所给类型肿瘤最有活性的衍生物，这拓展了有效的范围。
表1-3中所用符号代表了下面化合物PP/AsP/2/ArG/2-二/N-天冬氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐，PP/Glu/2/Arg/2-二/N-谷氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/CyS/2/Arg/2-二/N-半胱氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Ala/2/Arg/2-二/N丙氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Ser/2/Arg/2-二/N-丝氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Lys/2/Arg/2-二/N-赖氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Arg/2/Arg/2-二/N-精氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Trp/2/Arg/2-二/N-氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐PP/Met/2/Arg/2-二/N-蛋氨酰/-原卟啉l-精氨酸盐表1-3含有用于研究抗肿瘤剂的细胞株的下列符号原卟啉和HpD制剂的衍生物人肿瘤细胞株Hep-2 喉癌细胞Hela 子宫颈癌细胞KB 口腔癌细胞HBT-39/W 乳腺癌细胞T-47D 乳腺癌细胞P3HR1 Burkitt淋巴癌细胞鼠肿瘤细胞株
GRMT/F6 GR种小鼠的乳腺癌细胞Mm5MT/Cl C3H种小鼠的乳腺癌细胞MA-104 Rhesus猴胚胎肾癌细胞与已知HpD制剂比较，新的盐显示了进入各种类型肿瘤细胞的很强能力并显示出对癌细胞的强破坏作用。例如，用HpD的新1-精氨酸盐(HpD/Arg/2)，Hela细胞株，MA-104细胞株和HBT-39/W细胞株培育48小时后的活细胞百分比(P%)分别为13，6和0%，而用已知制剂，即HpD的钠盐(HpDNa2)，分别为28，17和10%。
新化合物也在动物上进行了研究。发明人选择了化合物PP/Lys/2/Arg/2用于例ⅩⅤⅡ，其是在研究Mm5MT/Cl细胞株(由C3H小鼠的乳腺癌)中最有活性的一种，及PP/Glu/2/Arg/2用于例ⅩⅤ，其是对该类肿瘤有最小有效的一种。
在动物研究中，移植乳腺癌的C3H小鼠以10mg/kg体重剂量按两种方式服用上述两种化合物一种是在图中用He-Ne激光器以150J/cm2剂量照射小鼠，用挨着化合物符号的字母L表示，和另一种不照射。结果见图。该结果指出1)由动物研究确证了在细胞株实验中得到的结果。
2)证明PP/LKys/2/Arg/2制剂最具活性，大大延长了小鼠存活时间;
3)原卟啉氨基酸衍生物对肿瘤细胞显示出细胞毒性;与没进行照射的比较，该作用在有激光器照射细胞情况中更强。
血卟啉和其衍生物复合盐的制备实施例实施例1HpD是血卟啉衍生物的混合物，如血卟啉，原卟啉，乙烯氘卟啉，二血卟啉醚或它们的聚集物的混合物。往1g HpD(平均分子量600，1.67mmol)的30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加581.8mgl-精氨酸(3.34mmol)的2ml水溶液。该混合物伴随猛烈搅拌于60℃水浴上加热15-20分钟。随后加100ml丙酮并继续搅拌3-5分钟。溶液放置5-15小时。在这期间，以HpD/Arg/2代表的盐混合物沉淀出来。滤出该沉淀，用乙醚洗涤，真空下干燥，干燥后，沉淀在空气中是稳定的;但为了保持卟啉含量必须避光保存。反应产率约为75%。
实施例2往1g HpD的20ml甲酰胺溶液中加入581.8mgl-精氨酸的2ml水溶液。该溶液如实施例1所述搅拌和加热。随后在冷却后加入100ml乙醚。搅拌溶液并静置几小时。滤出形成的沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥。得到的盐HpD/Arg/2的混合物为1264.8g，相当于产率86%。
实施例3往1230mg二赖氨酰原卟啉PP(Lys)2(1.4mmol)的40ml甲酰胺溶液中加入490mg L-精氨酸(2.8mmol)的1.5ml水溶液。该混合物在60℃水浴上加热约20分钟。冷却后，加100ml乙醚，搅拌该溶液，静置几小时。用乙醚洗涤形成的沉淀，真空下干燥。得到1630mg产物，相当于产率90%。该产物的分析数据列于表4中编号XXI。
实施例Ⅳ往1199.6mg(1.4mmol)二谷氨酰原卟啉的60ml甲酰胺溶液中加入409.3mg l-赖氨酸的1.5ml水溶液。该溶液于60℃加热30分钟，其中加入120ml丙酮-乙醚(1∶3)混合物;然后该混合物搅拌10分钟，静置几小时。真空下过滤形成的沉淀，用乙醚洗涤，真空下干燥，得到1575mg产物，其相当于产率97.8%。
实施例Ⅴ往1081.8mg(1.4mmol)二丝氨酰原卟啉的50ml甲酰胺溶液中加入490mg(2.8mmol)l-精氨酸的1.5ml水溶液。该溶液于60℃加热30分钟，其中加入120ml丙酮-乙醚(1∶3)混合物;然后搅拌该混合物50分钟，随后静置几小时以结晶。真空下滤出形成的沉淀，真空下用P2O5干燥。得到1500mg产物，其代表95.5%产率。
表4中的盐按实施例Ⅴ所述步骤制备，其包括PP/Ser/2/Arg/2-二/N-丝氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Glg/2/Arg/2-二/N-甘氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Ala/2/Arg/2-二/N-丙氨酰/原卟啉l-精氨酸盐
PP/Val/2/Arg/2-二/N-缬氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Leu/2/Arg/2-二/N-亮氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/ILeu/2/Arg/2-二/N-异亮氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Phen/2/Arg/2-二/N-苯丙氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Tyr/2/Arg/2-二/N-酪氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Pro/2/Arg/2-二/N-脯氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/ProoH/2/Arg/2-二/N-二羟脯氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Trp/2/Arg/2-二/N-氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Cys/2/Arg/2-二/N-半胱氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Met/2/Arg/2-二/N-蛋氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Asp/2/Arg/2-二/N-天冬氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Glu/2/Arg/2-二/N-谷氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Arg/2/Arg/2-二/N-精氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Lys/2/Arg/2-二/N-丝氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/LysoH/2/Arg/2-二/N-羟丝氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/His/2/Arg/2-二/N-组氨酰/原卟啉l-精氨酸盐PP/Asn/2/Arg/2-二/N-天冬酰氨/原卟啉l-精氨酸盐PP/Gln/2/Arg/2-二/N-谷氨酰氨/原卟啉l-精氨酸盐。

权利要求

1.通式1的血卟啉和其衍生物的复合盐
其中R1和R2相同或不同且为-CH=CH2，CH(OH)-CH3或-CH(OR3)-CH3，其中R3为形成含醚和/或酯的低聚物的基团，该基团含1-5个衍生于式2单体的相同或不同单元，
或R1和R2相同且代表-CH(R4)-CH3，其中R4代表羧甲基氨基，1-羧乙基氨基，1-羧-2-甲基丙氨基，1-羧-3-甲基-丁氨基，1-羧-2-甲基-丁氨基，1-羧丁氨基，1-羧戊氨基，1-羧-2-羟乙氨基，1-羧-2-羟-丙氨基，1-羧-2-巯基乙氨基，1-羧-3-甲硫基丙氨基，1，2-二羧乙氨基，1-羧-2-氨甲酰基-乙氨基，1，3-二羧丙氨基，1-羧-3-氨甲酰基丙氨基，1-羧-2-苯基-乙氨基，1-羧-2-(4-羟苯基)-乙氨基，1-羧-2-吲哚基-乙氨基，2-羧-吡咯烷基，2-羧-4-羟吡咯烷基，1-羧-5-氨基戊氨基，1-羟-4-胍基-丁氨基，1-羧-4-羟-5-氨基-戊氨基，或1-羧-2-(1H-咪唑)-乙氨基；A为碱性氨基酸；m为2-6，n为1-5。
2.权利要求1的盐，其中A为精氨酸，赖氨酸，组氨酸或羟赖氨酸。
3.权利要求1的盐，其中R1和R2相同且代表-CH(R4)-CH3。
4.含至少两种通式1的复合盐的混合物。
5.权利要求4的混合物，其含有血卟啉，原卟啉，乙烯氘卟啉和二血卟啉醚的氨基酸盐。
6.制备通式1血卟啉和其衍生物的新复合盐或通式1盐的混合物的方法，
其中式中各基团定义如权利要求1所定义，该方法特征在于将通式4的血卟啉衍生物或通式4的至少
两种衍生物的混合物(其中R1和R2具有上述定义，条件是如R1和R2为-CH(R4)-CH3，则取代基R4的羧基是游离或保护的)与带有游离或保护的羧基的碱性氨基酸或其单盐酸盐进行反应，保持羧基的基团可除去，作为产物的通式1盐或其混合物可分离出来。
7.权利要求6的方法，其中反应在有机溶剂，有机溶剂的混合物或含有机溶剂和水的介质或有机溶剂和水的混合物中进行。
8.权利要求6的方法，其中精氨酸，赖氨酸，组氨酸或羟组氨酸用作氨基酸。
9.权利要求6的方法，其中含血卟啉，原卟啉，乙烯氘卟啉和二血卟啉醚的混合物与精氨酸反应。
10.权利要求6的方法，其中该盐或其混合物是通过往反应混合物中加低极性溶剂或该溶剂混合物中分离的，所加溶剂可与反应中所用溶剂形成均匀溶液。
11.用于检测和/或肿瘤的剂，其含有通式1盐或其混合物，其中R1，R2，A，m和n如权利要求1定义。
12.权利要求11的剂，其含固体形式的通式1盐或其至少两种盐的混合物。
13.权利要求11的剂，其含通式1盐或其至少两种盐的混合物和药用稀释剂或载体。
14.无菌密闭容器，其含有固体形式的式1盐或其至少两种盐的混合物。