韦光绪;唐毅;殷志敏
【摘 要】Gamma-glutamyl transpeptidase(GGT),which was cloned from the genome li K－12,was used as a catalyst to synthesis γ-glutamylcystine,with L-glutamine and cystine as the substrate. After the reduction reaction and γ-glutamylcysteine was synthesized. We studied the effects of reaction time,initial enzyme concentration,feed mode of L-glutamine on the enzymatic process and find that the maximal production of GGC would be 6.13 g/L and the conver-sion rate of L-glutamine would be 24.5 %,when the initial reaction conditions of 0.1 mol/L of L-glutamine,0.2 mol/L of cystine and 0.024 U/mL of GGT,and the reaction is carried out at pH 10.0 and 40 ℃ for 12 h.%以大肠杆菌K－12基因组中克隆表达的γ－谷氨酰转肽酶作为催化剂,L－谷氨酰胺和胱氨酸为底物合成γ－谷氨酰胱氨酸,经还原生成γ－谷氨酰半胱氨酸.考察反应时间、酶浓度、补料方式等可能对酶促反应过程产生影响的因素,在L－谷氨酰胺0.1 mol/L、胱氨酸0.2 mol/L、酶浓度0.024 U/mL及pH为10.0的条件下,40℃反应12 h,γ－谷氨酰半胱氨酸的最大浓度为6.13 g/L,L－谷氨酰胺的最大转化率为24.5 %. 【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(041)002
【总页数】育苗杯6页(P78-82,88)
【关键词】γ－谷氨酰转肽酶;γ－谷氨酰半胱氨酸;胱氨酸;酶法合成
【作 者】韦光绪;唐毅;殷志敏
【作者单位】南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子与医学生物技术重点实验室,江苏 南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子与医学生物技术重点实验室,江苏 南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子与医学生物技术重点实验室,江苏 南京210023
【正文语种】中 文
【中图分类】Q555.3
还原型谷胱甘肽(GSH)由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸组成,是最具生物学价值的小分子肽.作为组织中主要的非蛋白巯基化合物,GSH能够清除组织中的氧自由基,稳定含巯基的酶及降低细胞因子的氧化损伤[1].因此,谷胱甘肽的代谢和调节对细胞内的氧化还原极为重要[2].
γ-谷氨酰半胱氨酸(GGC)作为体内合成谷胱甘肽(GSH)的中间产物,同时含有γ-谷氨酰基和巯基,其功能与GSH类似.研究表明GSH无法有效地进入细胞,且半胱氨酸在细胞外极易氧化成难溶的、具有毒性的胱氨酸,与直接提供GSH和半胱氨酸前药相比,GGC能够进入细胞利用胞内的谷胱甘肽合成酶直接合成GSH,对于提高细胞内GSH水平更为有效.因此,GGC在医药、食品及化妆品等领域具有广泛的应用前景[3].
近年来GGC的生产方式主要为酵母菌发酵法、化学合成法和CCT催化合成法3种. 酵母发酵法一般以糖类为原料,发酵周期长、产物浓度低、提取困难[4-5];化学合成法以谷氨酸和半胱氨酸为原料经过侧链基团保护、缩合接肽、脱保护进行合成,步骤繁琐,耗能大且安全性低[6];由于GGT具有位点专一性强、不需要辅酶、不消耗ATP等特点,已被广泛应用于谷氨酰基化产品的生产. 2006年Wallace Bridge等以谷氨酸乙酯和巯基乙醇还原的半胱氨酸为底物,
利用GGT酶催化合成GGC,收率可以达到30 %左右,已基本实现了工业化[7].2008年吴明刚等报道了以谷氨酰胺和S-苄基半胱氨酸为底物,利用GGT酶催化合成S-苄基-γ-谷氨酰半胱氨酸(S-Bzl-GGC),再脱除苄基制备产物GGC,收率可以达到29 %左右[8].
本工作利用在大肠杆菌Rosetta(DE3)中高效表达的GGT酶以L-谷氨酰胺和胱氨酸为底物催化反应,再通过二硫苏糖醇还原,两步反应得到终产物GGC,简化了GGC合成的工艺流程.
1 材料和方法
沥青透水混凝土1.1 主要材料
大肠杆菌 E.coli K-12和Rosetta(DE3)由本实验室自行筛选和保藏;GGC标品,Sigma;Gln,实验室自制;胱氨酸,谱纯,上海生工;二硫苏糖醇,上海生工;基因工程试剂盒,Axgeny;γ-GT检测试剂盒,南京建成;乙腈、甲醇等均为国产分析纯.
防误闭锁1.2 GGT的重组表达
电视升降机在NCBI中查询大肠杆菌K-12的γ-谷氨酰转肽酶基因序列,根据目的基因序列设计引物并引入酶切位点:
Kpn I 上游引物:GGGGTACCATGATAAAACCGACG;
Xho I 下游引物:CCCTCGAGTTAGTACCCCGCCG.
从大肠杆菌中克隆获得γ-谷氨酰转肽酶基因ggt,构建重组表达质粒pET32a(+)-ggt,并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,以1∶100比例接种于1 L的LB培养基中,37 ℃、220 rpm发酵2 h～3 h,在菌体浓度OD 600大约为0.6～0.8左右时加入复配诱导剂,26 ℃、220 r/min发酵8 h诱导蛋白表达,超声破碎细胞得到粗酶液放入-80 ℃保存.
1.3 重组GGT酶活力的测定方法
GGT催化谷氨酰对硝基苯胺(γ-GpNA)中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405 nm有特征光吸收.1个活力单位(U)定义为每分钟催化γ-GpNA 水解生成1 μmol 对硝基苯胺所需的酶量,因此通过紫外分光光度计测定405 nm光吸收增加速率来计算γ-GT酶活性[9].
1.4 目的产物GGC浓度检测方法
(1)产物的HPLC分析方法
谱柱为Agilent SB-C18,5 μm,4.6×250 mm;流动相为甲醇/水(含0.1%乙酸)=5/95;流速为0.6 mL/min;检测器为紫外检测器;检测波长为220 nm;进样量20 μL;柱温25 ℃.
(2)待测样品的处理方法
使用移液器吸100 μL发酵液置于1.5 mL离心管中,100 ℃加热3 min终止反应,加入300 μL 0.5 mol/L的二硫苏糖醇(DTT)摇匀,室温静置1 h～2 h.待充分还原后使用0.2 μm滤膜过滤,进行HPLC检测.
1.5 重组GGT酶学性质的研究
1.5.1 GGT最适反应温度
配制底物溶液浓度均为0.1 mol/L,GGT酶浓度均为0.024 U/mL,分别在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下反应30 min,通过HPLC检测产物浓度,以测得的最大反应速率为100 %,推算出各温度下的相对酶活.
1.5.2 GGT的热稳定性
核桃包装将GGT酶液分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃水浴保温,每隔1h取出一组样品,进行酶活测定,以初始酶活为100 %.以相对酶活力为纵坐标,温度为横坐标.
1.5.3 GGT最适反应pH值
配制底物溶液浓度均为0.1 mol/L,GGT酶浓度均为0.024 U/mL,分别在pH为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下反应30 min,通过HPLC检测产物浓度,以测得的最大反应速率为100 %,推算出各pH下的相对酶活.
1.6 GGT催化合成GGC的反应条件优化及表征
1.6.1 反应时间对GGT催化合成GGC反应的影响
采用100 mL的反应体系,将Gln和Cys-Cys溶解于水中,用氢氧化钠调pH至10.0,Gln浓度为 0.1 mol/L,Cys-Cys浓度为0.2 mol/L,加入GGT酶液使反应体系中酶的终浓度为0.024 U/mL,40 ℃,220 r/min 温控摇床反应,定时取样,通过HPLC对产物浓度进行分析.
1.6.2 GGT酶浓度对GGT催化合成GGC反应的影响
采用100 mL的反应体系,将Gln和Cys-Cys溶解于水中,用氢氧化钠调pH 至10.0,Gln浓度为0.1 mol/L,Cys-Cys浓度为0.2 mol/L,加入酶液使反应体系中酶的终浓度分别为0.016 U/mL、0.024 U/mL、0.032 U/mL,40 ℃,220 r/min温控摇床反应,定时取样,通过HPLC对产物浓度进行分析.
1.6.3 不同加料方式对GGT催化合成GGC反应的影响
采用100 mL的反应体系,将Cys-Cys溶解于水中,用氢氧化钠调pH 至10.0,Cys-Cys浓度固定为 0.2 mol/L,加入酶液使反应体系中酶的终浓度为0.024 U/mL,配制1mol/L的Gln标准溶液,底物Gln的加入分别采用一次性加料、分两次加料、分4次加料、流加4种不同投料方式.
2 结果与讨论
2.1 GGT的克隆与表达
2.1.1 ggt基因的克隆
A.M:DNA分子量标准;1:ggt目的片段. B.重组质粒pET32a(+)-ggt图谱图1 ggt基因的克隆Fig.1 Cloning of ggt li K-12
如图1A所示,从大肠杆菌K-12中克隆获得γ-谷氨酰转肽酶基因ggt全长约1 700 bp,引入Kpn I和Xho I酶切位点,以pET32a(+)为载体构建重组质粒pET32a(+)-ggt(图1-B).根据南京思普金生物公司提供的pET32a(+)的MCS 上下游序列,利用T7 promotor primer 和T7 teminator primer 作为测序引物,进行测序. 经南京思普金生物公司整菌测序结果表明,克隆的目的基因片段全长1 743 bp,与在NCBI 上BLAST 检索的E.coli K-12 ggt 基因编码序列同源性达100 %. 因此,可以确定ggt基因已经成功克隆到pET32a(+)载体中,且方向正确.铅黄铜
2.1.2 GGT的诱导表达
将重组菌以1%的接种量接入1 L的LB培养基中,设置摇床转速220 rpm,温度37 ℃,根据重组工程菌生长曲线(图2A)可以看出,4 h～10 h期间重组菌进入对数生长期,菌体进行快速繁殖,10 h后重组菌生长进入平台期,菌体量基本保持不变,因此在之后培养重组菌的时间控制在10 h 左右较为合适.菌株复配诱导8 h 后,收集超声波破壁,通过SDS-PAGE检测(图2B),重组GGT的分子量约为59 kDa,大亚基由365个氨基酸残基组成,分子量约为39 kDa,小亚基由190个氨基酸残基组成,分子量约为20 kDa. 利用全自动化学发光图像分析系统对条带灰度扫描分析,GGT蛋白表达量大约在37 %左右. 过γ-GT活性检测试剂盒检测重组GGT粗酶液酶活大约为0.8 U/mL,约是出发菌种E.coli K-12自身GGT酶活的14倍.
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