上海交通大学学报(医学版)
Journa l of Shanghai Ji ao t ong Un i versi ty(M edical Sc i ence)
V o.l 28N o .10O c.t 2008
基金项目：上海市教委自然科学基金(04BB23)(Shanghai Educati on C o mm ittee Found ati on,04BB23)。作者简介：刘 勇(1978-)，男，山东招远人，硕士生；:li m 。通讯作者：冯东福，:feng_d f @yahoo .co m 。
文章编号: 0258-5898(2008)10-1250-04
#论 著#
刘 勇1
, 陈二涛1
, 冯东福1
, 刘天津2
, 汪 洋3
, 潘栋超
1
(1.上海交通大学医学院第三人民医院神经外科，上海 201900;2.中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 200031;
3.复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系，上海 200032)
摘 要：目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF )与绿荧光蛋白(GFP )共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(N SCs)。方法运用基因重组技术，将hBDN F 基因连接到带GFP 的慢病毒表达载体p W PXL-M OD (p W PXL -G FP -I RES -GFP )中，构建慢病毒载体p W PXL-hBDNF-I RES -GFP ,M lu Ñ、E co R Ñ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒p W PX L -hBDNF-I RES -GFP 、包装质粒HEL PER 和包膜质粒VSVG 共转染293T 细胞，包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的p
W PX L -hBDNF-I RES -GFP 感染N SCs ，并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体p W PX L -hBDNF-IRES -EGFP 经M l u Ñ和Eco R Ñ双酶切反应鉴定正确；测序分析证实与G enbank 报道的hBDN F 基因序列完全一致。三质粒共转染293T 细胞后，荧光显微镜下可见大量绿荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1@109~1@109TU /mL 。p W PXL-hBDNF-IRES -GFP 感染后的N SCs 表达绿荧光，可在体外扩增,N SCs 细胞标志物巢蛋白表达阳性；细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF 与GFP 基因共表达的慢病毒载体并转染N SCs ，转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。关键词：脑源性神经营养因子; 绿荧光蛋白; 转染; 慢病毒中图分类号:
Q 78 文献标志码:A
C onstructi on of bicistron i c l enti vi rus vectors carryi ng hBDNF and GFP genes and
transfection of neural ste m cells
风送系统L I U Y ong 1
,CHEN Er -tao 1
,FENG D ong -fu 1
,LI U T ian -ji n 2
,WANG Y ang 3
,P AN D ong -chao
1
(1.D epart m ent o f N euros ur gery ,The Third Peo p le p sH os pital ,School of M edicine ,Shanghai J iaotong University ,Shanghai 201900,China; 2.Instit ute of B ioche m istry and Cell B iolo gy,Shanghai Institutes for B iological Sciences ,Chinese A cade my of Sciences ,Shanghai 200031,China ; 3.D epart m ent o f A nato my and H istolo gy and Em bryolo gy,Shanghai M e d ical College of Fudan University ,Shanghai 200032,Chi na )
Abstract : Obj ective T o c onstruct hu m an brain -deri ved neurotrophic factor (hBDNF )and green fl uorescent protein (GFP)c o -e xpressi ng lent i v iral vector ,and tra nsfect neura l ste m cells(NSCs). M ethods G e ne reco mb i nant technology w as e mployed to clone hBDN F and GFP genes to lent i v ir us vector p WPXL -MOD (p WPXL -GFP -I RES -GFP)to constr uct a le ntiviral vector p WPXL -hBDNF -I RES -GFP .M lu Ñand Eco R Ñe nzy m e di gest i on and seque nci ng analysis w ere use
d for i dentificat i on .Then ,293T cellsw ere transfected w ith m ai n vector p WPXL -hBDNF -I RES -GFP ,pac kag i ng plas m idHELPER and coated plas m i d VSVG .Lent i v iral vectorsw ere pac ka ged and the titer was deter m ined .The constr ucted p WPXL -hBDNF -I RES -GFP w as used to i nfect N SCs ,and the i nfected cellsw ere i dentified and the differentiat i ng acti v ities were deter m ined .R esults The lent i v ir a l vector plas m id p W P XL -hBDNF -I RES -EGFP w as i de ntified correct by M lu Ñand Eco R Ñe nzy m e di gestion ,and DNA sequencing analysis confir m ed that hBDNF gene sequenci ng w as exactly the sa m e w ith that reported by G enbank .A fter tr ansfection ,a large nu mber of 293T cells w ith gree n fl uorescence was obser ved by fl uorescentm icroscopy .T he conce ntr at i on of the v ir us t iterw as 0.1@109-1@109
TU /mL .A fter infecti on w ith p W P XL -hBDNF -I RES -GFP ,N SCs expressed gree n fl ourescence and nest i n ,and could d ifferentiate i nto neurons and g lial cells . Conclusion hBDN F w ith GFP gene expressi on le ntiviral vectors can be successfull y constr ucte d .A fter i nfect i on ,NSCs can m ai ntain the i ntri nsic b i o l og ical c haracteristics and d ifferentiati ng act i v ities .
K ey words : br a i n -derived neurotrophic factor ; green fl uorescent prote i n ; transfection ; lenti v ir us
#
1250#
N o.10刘勇，等：人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染
目前基因中目的基因的转移工具多采用病毒载体，由于慢病毒载体具有可容纳大片段的外源性基因，可使后者在体内较长期表达目的基因，并具有免疫反应小、安全性较好等优点，因而受到众多研究者的青睐。目前，已有研究利用慢病毒载体成功进行了神经生长因子(never gro w th factor,NGF)等基因修饰，但尚未见利用慢病毒载体介导脑源性神经营养因子(brain deri v ed neurotroph ic factor,BDNF)和绿荧光蛋白(green fluorescent pr o tein,GFP)基因共表达转染神经干细胞(neura l ste m cells,NSCs)的报道。本实验尝试构建人B DNF(hBDNF)和GFP基因共表达的慢病毒载体(p W PXL-hBDNF-I R ES-GFP)并感染NSC s，观察和分析感染后NSCs的生物学特性及分化活性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、菌株和细胞：质粒p W PXL-MOD (p W PXL-GFP-I RES-GFP)由中科院生化细胞所赠送；大肠杆菌菌株DH5A、人胚肾细胞系(293T细胞)由中科院生化细胞所保存。
1.1.2主要酶和试剂：限制性内切酶M luÑ和
E co RÑ、1kp DNA ladder M arker(Fer m entas);250bp DNA ladderM ar ker(捷瑞公司);T4DNA li g ase(NEB); Taq po l y m erase(Takara);dNTP(Pro m ega);Plas m id抽提K it(Q i a gen);Lipo fecta m i n e2000(I nvitrogen)；胎牛血清(上海微科生化试剂有限公司)；胰酶(上海化学试剂公司)；兔抗GFAP一抗(武汉博士德)；兔抗小鼠nestin一抗、小鼠抗B-tubulin一抗(Che m icon)；羊抗兔Ig G-Cy3二抗、羊抗小鼠Ig G-Cy3二抗(S i g m a)。
1.2p W PXL-hBDNF-I R ES-GFP构建及鉴定
1.2.1引物设计与合成：根据GenBank的hBdn f基因编码区(CDS)设计相应引物；根据载体质粒p W PXL-MOD要求在引物中引入M luÑ和E co RÑ酶切位点，引物由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物序列:5c-GACGCGTCGGATCCGTGATGAC CATCCT-3c；下游引物序列为:5c-GGAATTCGGTC GAC TCCACTATCTTCCC-3c(划线部分为酶切位点)。
1.2.2hBDNF基因的提取和鉴定:hBDNF基因由中科院生化细胞所从人胎盘组织提取并保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增后获得的hB DNF基因产物。将剩余PCR产物全部进行凝胶电泳后回收。
1.2.3重组慢病毒载体构建和鉴定:¹PCR反应产物与病毒载体定向连接及鉴定：将质粒p W PXL-GFP-
I RES-GFP和PCR反应回收产物经限制性内切酶M luÑ和Eco RÑ双酶切，按照以下反应体系将PCR
产物定向连接入病毒载体。将连接产物转化感受态细胞DH5A，将150L L已转化的感受态细胞DH5A 转移到含20mm o l/L M gSO4和Am p抗性的SOB琼脂培养基上，室温至液体吸收，倒置平皿，于37e培养16h。取单菌落扩增的菌液，小量快速抽提质粒DNA，用M luÑ和E co RÑ双酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时送上海生工生物技术有限公司进行测序分析，以鉴定插入DNA片段的正确性。º纯化目的基因片段与线性化的载体质粒定向连接及鉴定：克隆载体经限制性内切酶M luÑ和E co RÑ双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取目的基因片段，使用胶回收试剂盒回收纯化目的片段；慢病毒载体中载体质粒p WPXL-I R ES-GFP用限制性内切酶M luÑ和E co RÑ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳证实已完全线性化后，回收纯化。将纯化的目的基因片段与线性化的载体质粒进行连接、转化、质粒小量快速抽提，然后进行双酶切反应和测序分析鉴定(上海生工生物技术有限公司)。
1.3转染293T细胞及病毒滴度测定¹转染293T 细胞：采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒细胞包装系统(主体质粒p W PXL-hB DNF-I RES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG)共转染293T细胞。收集病毒上清(p W PXL-hBDNF-I R ES-GFP组和p W PXL-I RES-GFP组各30mL),4e下50000@g离心
2.5h沉淀病毒颗粒，弃上清各用1mL PBS重悬病毒，分装为10L L/EP管,-70e保存。胰酶消化计数293T细胞，以2@105/孔接种到6孔板中。置于37e、5%CO2孵箱中培养至细胞50%融合。取慢病毒液，连续稀释法稀释至5个浓度(10-1~10-5)，终体积1m L。弃去细胞培养液，将上述各浓度病毒液(包括原液)分别加至6孔板中。病毒滴度测定:72h 后荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数以计算病毒滴度(病
毒滴度=GFP阳性细胞率@细胞总数/慢病毒液体积@慢病毒液稀释倍数)(TU/m L)。为避免误差，只选择GFP阳性细胞率为1%~30%孔进行计算，取各组平均值计算滴度。
1.4转染NSC s后细胞鉴定及分化活性检测利用构建并包装后的慢病毒载体按2B1转染体外传代培养的第3代NSC s并继续传代培养，观察细胞形态学变化。采用免疫荧光染法[1]检测NSCs细胞标志物巢蛋白(nesti n)的表达；细胞贴壁后(7d)分别检测神经胶质细胞和神经元细胞标志物胶质纤维酸性菜罩
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1251
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上海交通大学学报(医学版)
V o.l 28
蛋白(g li a l fi b rillary acidic pr o te i n ,GFAP)和B -微管
蛋白(B -tubulin)的表达。
2 结 果
2.1 提取hBDNF 基因的鉴定 从人胎盘组织中提
取获得的hBDNF 基因编码区DNA 片段经PCR 扩增
后，于1%琼脂糖电泳中可见744bp 的特异条带，与
理论值一致(图1)
。
图1 1%琼脂糖凝胶电泳检测hBDN F 基因
F i g 1 h BDNF gene detected by 1%agarose gel electrophoresis
2.2 p W PXL -hBDNF -I R ES-GFP 的鉴定 hBdnf 基因
的PCR 产物经M lu Ñ和Eco R Ñ双酶切后可见744bp
目的基因片段(图2)。回收并纯化的hBdn f 片段与
经M lu Ñ和E co R Ñ双酶切后线性化慢病毒载体质粒
PNL -I R ES -GFP 连接所得的重组质粒(p W PXL -hBDNF -
I R ES-GFP)经M lu Ñ和E co R Ñ双酶切和1%琼脂糖电
泳鉴定正确(图3)；上海生工生物技术有限公司测序
结果表明,Bdnf 基因序列正确，无突变或缺失。提示
克隆成功。
2.3 三质粒共转染293T 细胞观察及病毒滴度测定
转染后48h，荧光显微镜观察可见大量绿荧光(图
4A )，提示转染成功。经计算病毒滴度为0.1@109
~
1@109
TU /mL
。
图2 限制性酶切鉴定阳性克隆产物
F ig 2
Pos itive product of cl oning identifi ed by restriction enzy m e
digestion
M:m arker ;1:negative con tro;l 3,4,6:negti ve cl one ;2,5,7.8:PCR
produ ct of positive clone d i gested by M lu Ñ/E co R
Ñ
奶啤酒图3 重组质粒限制性酶切鉴定
F ig 3
Identifi ca ti on of recombinant plas m i d by restriction enzy m e
di gesti on
M:m arker ;1:negati ve con tro;l 2,3,4:PCR product of hBDNF d i gested
by M l u Ñ/Eco R Ñ
2.4 p W PXL -hBDNF -I R ES -GFP 转染NSCs 及相关检测2.4.1 形态学观察：转染48h 后，荧光显微镜下即
观察到细胞克隆内有散在表达微弱绿荧光的细
胞，随着时间延长，表达绿荧光的细胞数量增多,
荧光强度增强。转染细胞经3次传代后，细胞状态良好，荧光显微镜下可见神经球发出炫目的绿荧
光(图4B)，细胞贴壁后仍可以迅速伸出突起，并向
周围迁移，形态上可见分化为神经元样或神经胶质
样细胞(图4C ),
并均能表达强烈绿荧光。图4 荧光显微镜观察慢病毒载体转染后细胞形态
@200
F i g 4 M orpho l og i c obs ervati on o f cells transfected w ith l enti v iral vector by fluorescent m icroscopy
@200
A :293T cells 48h after transfecti on ;B:cl one of NSC s 48h after transfecti on (hBDNF -GFP -NSC s);C :d iff eren tiat ed hBDNF -GFP -NSC s
#
1252#
N o .10
刘 勇，等：人BDNF 和GFP 基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染
2.4.2 细胞标志物表达检测：免疫荧光染观察显
示，经nestin 标记Cy3染(红)联合DAPI(蓝)
标记细胞核，大部分细胞表达nestin(图5A )。NSC s 体外贴壁分化7d 后，神经球球体大部分细胞迁移至
四周并呈现强绿荧光。免疫荧光染后，可见培
养的神经球既能分化为GFAP 表达阳性的神经胶质
细胞(图5B )，也能分化为阳性表达B -tubulin 的神经元(图5C )
。
图5 免疫荧光染鉴定细胞标志物态
F i g 5 Identifi ca ti on of cellma rkers w it h i mm uno fluorescent s t a i ning
A:nesti n m ar k ed NSC s s t ained by Cy3and DAP I @200;B:gli al cells m ark ed by GFAP @320;C:neu ron s m ark ed by B -t ubu li n @200
3 讨 论
基于NSC s 的细胞替代已成为中枢神经系
chdtv统疾病研究的热点，并取得了一定的进展。然而，由
于NSCs 分化和增殖机制比较复杂，其分化为神经元
的比例较低[2]
。
近年来,BDNF 作为一种新型的神经修复药物受到越来越广泛的关注。BDNF 在体内分布广泛，但主
要集中表达于中枢神经系统，对于维持神经元存活
和突触联系具有重要作用。已有报道[3]
脑损伤后
BDNF 表达出现明显上调；将BDNF 注入大鼠海马内后，可以促进齿状回及相邻区域神经再生，神经元数
量增加[4]
。近年来,BDNF 在视神经损伤修复中的作
用也引起众多研究者的重视。研究菜罩
[5-6]
发现，外源性
BDNF 可以增加视网膜损伤后局部BDNF 浓度，增加感光细胞的存活数量。然而，注射后B DNF 在局部表达时间短，而局部反复注射在临床上较为困难，且
有引起感染的危险。
通过基因工程技术对NSCs 进行基因修饰或转基因处理为神经损伤修复提供了新的思路。通过基
因转染技术，可将目的基因转染到目的细胞中使之
长期稳定表达，而不需要反复注射。目前进行基因
转染的方法较多，常用的有电穿孔转染和病毒转染。电穿孔转染的方法操作简单、费用低、没有生物化学
毒性，然而其转染效率低、细胞损伤大。病毒载体种
类较多，常用的有腺病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒等。腺病毒和单纯疱疹病毒均可以携带大DNA 片
段，能够转染多种细胞，然而它们的转染效率较低，有较高的抗原性和毒性，且转染后不能将目的基因
整合到靶细胞染体中，只能短暂表达[7-8]
。而慢病
毒不仅具有毒力低、转染效率高、可转染不同时相细
胞、能够携带大片段基因的优点，更重要的是能将目
的基因整合到宿主细胞染体中，理论上能够在细胞存活期内永生表达并在子代中稳定表达。且有研
究
[9]
证实，使用慢病毒载体进行体外实验未出现过有复制能力的病毒，说明慢病毒载体具有较好的生
物安全性。
本实验构建了三质粒包装系统的慢病毒载体,
将hBDNF 基因(目的基因)和GFP 基因(报告基因)
通过I R ES(核糖体内部进入序列)连接并转入到慢病毒主体质粒中，载体中的I RES 可以使hBDNF 和
GFP 分别在细胞内表达。在载体质粒共转染293T
细胞48h 后即通过荧光显微镜观察到大量绿荧
光，说明载体质粒转染入293T 细胞。同时，病毒滴
度测定结果显示，获得的病毒滴度为0.1@109
~1@
109
TU /mL ，这可能与使用改良的磷酸钙沉淀法提高
了病毒滴度有关。近年来虽已有利用慢病毒构建基因转染载体的研究，但同时进行hBDNF 和GFP 基因
转染的研究还很少。本实验在hBDNF 转染的同时加
入了与之共表达的报告基因GFP ，这将更有利于转
染后对移植细胞进行体内或体外的示踪研究。
为了验证所构建载体的活性与安全性，我们利
用其转染体外培养的NSCs ，结果发现，转染后的
NSCs 同样能够表达特异性标记物nestin ，贴壁后形态上可以分化为神经元和神经胶质细胞，传代后持续
(下转第1257页)
#
1253#
N o.10周瑞庆，等：三种黏接材料的体外微渗漏研究
离子水门汀在固化过程中，材料中的自由基团呈现一定酸性，每个羧酸盐基团，可穿过磷灰石基质，取代一个钙离子和一个磷酸盐基团，导致玻璃离子水门汀与牙齿间界面上形成富离子层，从而两者间
结合成具有相当强度的整体，形成了水门汀与牙体间较强的黏接力，增加了固位效果[7]。玻璃离子水门汀具有与牙体组织相近的线胀系数和热膨胀系数，因此具有比自酸蚀黏接剂更强的对抗微渗漏的能力。
综上所述，自酸蚀、全酸蚀黏接剂黏接纳米复合树脂修复以及玻璃离子水门汀修复均存在微渗漏，尤其是龈壁处。自酸蚀黏接剂黏接修复微渗漏大于全酸蚀黏接剂黏接修复和玻璃离子水门汀。
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470.
收稿日期:2008-05-27本文编辑：王淑平
(上接第1253页)
表达强绿荧光。说明利用构建的慢病毒载体感染NSCs后，其干细胞性质和分化活性并未受到明显影响；而能够表达强烈的绿荧光表明载体转染到NSCs染体内。
综上所述，本实验成功构建了hBDNF和GFP基因共表达的高滴度慢病毒载体，具有良好的转染活性；其转染NSCs后并未对细胞的生物学活性产生影响，为NSCs的基因转染提供了较为安全且有效的载体工具。
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收稿日期:2008-05-15本文编辑：王淑平
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