菌物系统22（1）：112~117, 2002
Mycosystema
刘安玲朱必凤刘主彭晓云
(广东省韶关学院生物工程系广东韶关512005)
摘要：应用快速灌注谱系统首次从经Cd2+诱导的柱状田头菇（茶薪菇）Agrocybe
cylindracea (DC.：Fr: ) R. Maoire菌丝体中分离得到一种镉结合蛋白。通过Sephadex G-75凝
胶过滤层析，原子吸收光谱分析(AAS)，巯基含量测定及紫外吸收光谱分析表明这种镉结合
蛋白具有金属硫蛋白(metallothionein, MT)的理化性质：即分子量为6 kDa、每分子MT含18
个半胱氨酸残基并结合7个镉原子、具有镉硫金属簇的特征紫外吸收光谱，初步鉴定为茶薪
菇Cd-MT。
关键词：镉金属硫蛋白, 灌注谱, 提纯
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1007-3515（2003）01-0112-0117
食(药)用菌对微量元素具有富集或生物转化作用，但这些微量元素中也包括一些有害的重金属元素，它们进入人体后影响食用者的健康。因此，加强食(药)用菌与重金属之间关系的研究意义重大(邢增涛等，2000)。
金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类广泛存在于生物界的富含半胱氨酸、可被重金属、激素和各种细胞因子诱导的低分子量金属结合蛋白。它的生物功能的多样化，包括微量元素储存、运输、代谢，重金属解毒，拮抗电离辐射、清除羟基自由基等，预示在医药、保健、环保、贵重金属回收等领域有着广阔应用前景(刘安玲和朱必凤，2001)。目前，MT已成为分子生物进化和蛋白质结构功能研究领域的热门课题。自1957年Margoshes和Vallee (Margoshes & Valle, 1957)从马肾脏中分离出镉金属硫蛋白(Cd-MT)至今，已从动物、植物、微生物中分离得到各种MT(张晓钰和茹炳根，2000)。与其它物种相比，真菌MT研究得较晚，且涉及食用菌的极少，目前仅见双孢蘑菇Agaricus bisporus MT(Münger & Lerch, 1985)。柱状田头菇（茶薪菇）Agrocybe cylindracea(DC.：Fr: ) R. Maoire是一种食用及药用价值很高的菌类，食味独特，营养丰富，具有抗衰老、降低胆固醇、防癌和抗癌的特殊功效(张飞翔，1999)。为此，本文以柱状田头菇（茶薪菇）菌丝体为材料，应用快速灌注谱系统对柱状田头
菇（茶薪菇）MT进行分离纯化并研究了其理化特性，为进一步了解MT在食用真菌中的分布，指示真菌MT与其他物种MT之间的异同提供实验依据。
∗国家自然科学基金资助项目
E-mail: anlingliu@yahoo; anling-liu@21cn
收原稿日期：2002-03-05，收修改稿日期：2002-04-16
1期刘安玲等： 茶薪菇金属硫蛋白的分离纯化与特性研究 113 1材料与方法led日光灯灯座
1.1试剂与材料
POROS 20HQ谱填料，美国PE BIOSYSTEM；Sephadex G-75、G-25，瑞士Amersham Pharmacia Biotech ；5,5’-二巯基对硝基苯甲酸(DTNB) 为Sigma公司产品；分子量标准蛋白质(胰蛋白酶抑制剂、细胞素C、á-乳清蛋白、á-胰凝乳蛋白酶、碳酸酐酶、卵清蛋白)、牛血红蛋白及蓝葡聚糖-2000，购自北京邦定泰克生物技术公司；牛血清白蛋白(BSA)，上海伯奥生物科技有限公司产品；柱状田头菇（茶薪菇），引自江西省广昌县。
1.2仪器
BioCAD 700E 灌注谱系统，美国PE BIOSYSTEM；Ultrospec 2000 紫外/可见分光光度计，瑞士Amersham Pharmacia Biotech；原子吸收分光光度计(北京第二光学仪器厂)；大容量冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER；冷冻干燥机，丹麦Heto；VCF1500超声波细胞破碎仪，英国JENCONS；Maxima Scientific超纯水系统，英国ELGA。
1.3方法
1.3.1柱状田头菇（茶薪菇）菌丝体培养及镉诱导：柱状田头菇（茶薪菇）液体菌种在培养液(含不同浓度 CdCl2，以不加CdCl2的培养液为对照)中25℃恒温振荡培养，转速150 r/min。培养不同时间后，抽滤收集菌丝体，无金属水洗涤并立即冷冻干燥，贮存于-80℃。
1.3.2 无细胞抽提液的制备：取冻干菌丝按1∶2（w/v，即g/ml）溶于50 mmol/L PBS pH 7.2中，冰浴条件下超声破碎，再经4℃10, 000 g离心20 min，取上清。在上清中加入CdCl2溶液，每克菌丝加终浓度为200 µg的Cd2+离子。然后置80℃水浴2 min，迅速冷却，再4℃10,000g离心20 min，所得上清用70%乙醇沉淀过夜，离心，沉淀用Tris-HCl(浓度20 mmol/L，pH 8.6)溶解即为无细胞抽提液。
1.3.3 灌注谱法：BioCAD 700E工作站，紫外检测器(激发波长为254及280 nm), pH、温度、压力、电导率检测器内置，单柱，POROS 20HQ，直径4.6 mm，床体积1.667ml。取适当抽提液，按分离方案分离纯化，流速范围0.2~5 ml/min，采用波峰跟踪技术，另以原子吸收光谱(AAS)法测定峰组分的镉
含量，初步发现富含Cd且A254>A280的组分为待分离的峰。再优化分离条件，最终得到满意的分离图谱。收集目的组分，经适当浓缩后，Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥成纯品。将纯品溶于超纯水中，稀释成不同质量百分比浓度，分装后-80℃冻存。1.3.4 分子量测定：按常规凝胶过滤层析法测定(李如亮，1998)。
1.3.5 金属含量的测定：采用火焰法原子吸收光谱(AAS)测金属含量。取一定量MT纯化样品，测定AAS吸收值，并参照标准镉浓度计算金属量及每分子柱状田头菇（茶薪菇）MT结合Cd的摩尔数。
1.3.6 巯基含量的测定：用Ellman’s方法测定巯基含量。将约为0.02 µmol纯化MT样品配成小于50µl溶液，加入10 µl 1.2 mol/L HCl和200 µl 0.1 mol/L EDTA反应10 min脱去金属, 再加入200µl Ellman’s试剂（含5 mmol/L DTNB，1 mmol/L EDTA，6 mol/L 盐酸胍，0.1 mol/L PBS，pH7.2）混匀3 min，使MT变性后与DTNB形成黄络合物。用0.1 mol/L pH 7.2 PBS 稀释至4 ml在412 nm处测紫外吸收值，得到巯基含量，再以巯基含量比上MT含量即为每分子柱状田头菇（茶薪菇）MT含巯基的量。
114 菌 物 系 统 22卷
1.3.7 紫外吸收光谱特性：约40 µg 样品溶于2 ml 0.01 mol/L PBS 中，混匀后190-300nm 紫外区连续扫描；然后加入40 µl 2 mol/L HCl ，使HCl 终浓度为0.04 mol/L ，同样在紫外区连续扫描。
1.3.8 金属结合特性研究：(1) 脱金属MT （Apo-MT ）的制备：取一定量样品溶于pH 1.0的HCl 中，样品浓度约为2 mg/ml ，37℃保温15 min ，确定所得蛋白含量(李如亮，1998)。(2) 固定pH 值，改变加入Cd 2+ 比例的样品紫外吸收测定：将上述脱金属的蛋白分为8等份，每份样品为1 ml ，浓度为0.1mg/ml ，然后在八份样品中，分别加入1，2，3，4，5，6，7，8 eq Cd 2+ (eq ：equivalent ，当量)，再调pH 值到7.2，测定A 254的紫外吸收值。(3) 固定加入Cd 2+ 比例 (饱和量)，改变pH 值的样品紫外吸收测定：向上述脱金属样品中加入使其饱和的Cd 2+，然后用0.1mol/L HCl 逐渐调节pH 值分别为
2.0，
3.0，
4.0，
5.0，
6.0和
7.0，测定A 254紫外吸收值。
1.3.9 镉-血红蛋白饱和法测定MT 含量：取无细胞抽提液，加CdCl 2 (使Cd 2+终浓度为50 µg/ml)，室温放置5 min 。加入牛血红蛋白（2%，W/V ），于100 ℃加热1.5 min ，冰浴速冷，4℃ 10,000g 离心15 min ，取上清，重复一次。火焰法原子吸收光谱测定Cd 2＋含量，并根据前述测得的MT 分子量及每分子MT 镉含量计算MT 含量。
MT 含量＝（Cd 含量/镉的原子量/每分子MT 结合镉的个数）×MT 分子量。
以上结果重复3次，数据按统计学方法处理，均以X ±S 表示。
2 结果与分析
2.1 柱状田头菇（茶薪菇）金属硫蛋白的诱导
以不同浓度Cd 2＋诱导柱状田头菇（茶薪菇）菌丝体6 d 后以镉-血红蛋白饱和法测MT 含量，结果见图1。不加Cd 2+诱导时，柱状田头菇（茶薪菇）菌丝体内仍有极少量Cd-MT 存在，可能是因为培养基本身含有微量的Cd 引起的；在低于0.5 mmol/L 下，Cd-MT 随CdCl 2浓度增加而增加，但在1 mmol/L 的高浓度下，菌丝体生长缓慢，数量少，诱导产生的MT 也大大减少。以0.5 mmol/L CdCl 2诱导柱状田头菇（茶薪菇）不同时间后，菌丝体Cd-MT 含量见图
2。结果表明Cd-MT 含量在4 d 时较少，5 d 达最大量，以后随时间增加，Cd-MT 反而减少。
图1 不同浓度Cd 2＋诱导6 d 时茶薪菇
Cd-MT 含量
Fig. 1 Cd-MT value in Agaricus bisporus
exposed to different concentration
of Cd 2+ for 6 d 图2 0.5 mmol/L Cd 2＋诱导不同时间茶薪菇Cd-MT 含量 Fig. 2 Cd-MT value in Agaricus bisporus exposed to 0.5 mmol/L Cd 2+ for
different times
０
１００２００３００４００５００６００７００８０００．０００．１００．２５０．５０１．００Ｃｄ２＋浓度 Ｃｄ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ｍｍｏｌ／Ｌ）C d -M T 含量 C d -M T v a l u e (μｇ／ｇ
）
０１００２００３００４００５００６００７００８０００．０００．１００．２５０．５０１．００
Ｃｄ２＋浓度 Ｃｄ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ｍｍｏｌ／Ｌ）
C d -M T 含量 C d -M T v a l u e (μｇ／ｇ）
1期 刘安玲等： 茶薪菇金属硫蛋白的分离纯化与特性研究 115 图4 茶薪菇Cd-MT 的紫外扫描图 1. MT ；2. 脱金属MT （Apo-MT ） Fig. 4 Ultra-violet scan of Cd-MT from Agaricus bisporus
因此，5 d 为最佳诱导时间。
2.2 柱状田头菇（茶薪菇）金属硫蛋白的分离与纯化
无细胞抽提液经BioCAD 700E 灌注层析系统分离结果见图3。添加Cd 2＋诱导的提取液中峰I 位置出现了A 254>A 280的Cd 2＋结合蛋白峰，对照组未见Cd 2＋结合蛋白质峰，表明此峰确为Cd 2＋诱导的金属结合蛋白质峰。收集富含Cd 2＋、A 254>A 280的蛋白组分，经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥成纯品。用此法20 g 菌丝体可纯化得到8-12 mg Cd-MT 纯品。
2.3 柱状田头菇（茶薪菇）金属硫蛋白的鉴定及特性研究
2.3.1 分子量：根据Sephadex G-75凝胶过滤层析得出的标准分子量曲线及柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 的K d 值，计算出其分子量约为6000 Da 。
2.3.2 金属含量：由Cd 标准曲线测样品（5 µg/ml ）中含Cd 量为0.764 µg/ml ，并根据上述测得的柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 分子量计算出每分子MT 结合约7个镉原子。
2.3.3 巯基含量：柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 经脱金属加入巯基试剂反应后，根据 412 nm 处紫外光吸收值计算得巯基含量为0.363 µmol/L ，它与蛋白含量（0.02 µmol/L ）之比就得出每分子柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 约含18个巯基。
2.3.4 紫外吸收光谱特征：柱状田头菇（茶薪菇）MT 紫外扫描光谱分析结果见图4，在 254nm 附近有
一紫外吸收肩峰，而脱金属状态无此峰。这一特性与镉硫金属簇的紫外吸收特性相符合。
2.3.5 金属结合特性： 脱金属样品254 nm 紫外吸收值随着加入Cd 2+当量的增加而不断增强，7当量时达到最大值(图5)。加入饱和量Cd 2+时，脱金属样品紫外吸收值从pH 值为3.0时开始明显升高，并随着pH 值的升高而不断增强，但pH 值为4.0以上时，增长变慢(图6)。
0.0
1.0
2.0
190200210220230240250260270280290300通脉汤
Absorbance
116 菌 物 系 统 22卷 3 讨论
柱状田头菇（茶薪菇）是一种名贵珍稀的食用菌，隶属于真菌门担子菌纲伞菌目粪锈伞科田蘑属。本文根据食用菌在重金属环境中常贮集Cd 、Cu 、Ag 等重金属的这一特性，用Cd 2+诱导柱状田头菇（茶薪菇）菌丝体并从中分离纯化得到一种镉结合蛋白，初步鉴定为柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 。其氨基酸组成与一级结构分析，确证是否有Cys-X-Cys(X 为除Cys 外其他氨基酸)典型MT 序列等工作正在进行中。
MT 的一个重要特征就是具有可诱导性，各种诱导剂对MT 的诱导合成一般存在时间－剂量依赖效应(Kramer et al ., 1996)。本文结果表明在低Cd 2+浓度下，柱状田头菇（茶薪菇）产生的MT 随Cd 2+浓度升高而增加，但在过高Cd 2+浓度下，产生的MT 反而减少。时间效应也是如此。这是因为外界环境Cd 2+浓度过高时，菌丝体摄入的Cd 2+主要以游离形式存在，表现为很强的细胞毒性，使菌丝体生长缓慢，数量减少。这一时间－剂量效应也与MT 在一定浓度外界金属离子状态时能富集金属离子从而起解毒作用的功能一致。
本文所采用的BioCAD 700E 灌注谱系统分离纯化MT ，在文献上报道很少。该系统是一种应用独特的灌注谱层析技术来分离纯化及分析活性物质的系统，它配有UV 、pH 计、电导仪、自动收集装置及配套的控制与分析软件。本实验所用的层析介质为POROS 20HQ ，POROS 填料有许多放射性分布的孔径，颗粒内部流动及扩散路径缩短的结合使分离物质分布到整个颗粒内表面的速度大大加快，而且不以损失分辨率及分离能力为代价(Dabrio et al ., 2002)，在改进和简化蛋白质等大分子分离方法和增加回收率方面有其独特的优势(Hill et al ., 2001)。本文结果表明灌注谱法非常适合于柱状田头菇（茶薪菇）Cd-MT 的分离纯化：快速高效，单次分离过程只需7~8 min ，1d 内得到优化的分离工艺，分离效果好；自动化程度高，且容易规模放大，只需按一定的条件设定好程序，该系统即能在电脑控制下自动完成进样、洗脱、UV
带外衰减检测、收集等步骤，同时还可根据配套软件进行分析；重复性好，本文经多０
０．１
０．２
０．３
０．４
０．５
０．６
１２３４５６７８２＋（ｅｑ）Ａ
２５４
０
０．１０．２０．３
０．４０．５２．０３．０４．０５．０６．０７．０
ｐＨＡ２５４图5 加入不同比例的Cd 2+对 Apo-MT
254 nm 紫外吸收值的影响
Fig. 5 Effect of Cd 2+ on 254 nm OD value of
Apo-MT 图6 pH 值对Apo-MT 254nm 紫外吸收值的影响 Fig. 6 Effect of pH on 254 nm OD value of Apo-MT
1期刘安玲等： 茶薪菇金属硫蛋白的分离纯化与特性研究 117 次层析分离得到的结果一致，样品纯度高。
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ISOLATION, PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF
METALLOTHIONEIN FROM AGROCYBE CYLINDRACEA
LIU An-Ling ZHU Bi-Feng LIU Zhu PENG Xiao-Yun
(Department of Biotechnology, Shaoguan College, Shaoguan 512005)
ABSTRACT: A cadmium-binding protein has been firstly purified from cadmium-exposed Agrocybe cylindracea cultures by BioCAD 700E perfusion chromatography workstation. Physiological and chemical characterizations of the protein are analyzed by Sephadex G-75 Gel chromatography, and atomic absorption spectroscopy, mercapto groups content assay and Ultraviolet spectroscopy. It is primarily considered to be a cadmium-metallothionein (Cd-MT) based on its protein has the characteristics of metallothionein: 6 kDa molecular weights, 18 cysteic residues, binding 7 atoms of cadmium per molecule and the Ultraviolet absorption properties of Cd-thiolate cluster. The advantages of perfusion chromatography in MT purification were also discussed here.
KEY WORDS：Cd-metallothionein, perfusion chromatography, purify
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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