水烟doi ：10.3969／j.issn.2095⁃1736.2021.02.065
周铭典1，2
，蔡冠竟1，宁
静1，朱葛夫1
（1.中国科学院城市环境研究所，厦门361021；2.中国科学院大学，北京100049）
摘
要
通过平板涂布培养法和Salkowski 比法对堆肥中具有产吲哚乙酸（IAA ）能力的菌株进行初步筛选，并进一 步利用分光光度法定量复筛其中具有高产IAA 能力的菌株。试验共分离得到3株具有产IAA 能力的菌株，其中菌株29B 具有较强分泌IAA 的能力，培养96h 时IAA 产量达到54.73μg /mL 。通过菌株形态观察、部
分生理生化特性测定及16S rDNA 基因序列分析对菌株29B 进行分类鉴定，初步确定菌株29B 为停滞棒杆菌（Corynebacterium stationis ）。设计单因素试验以IAA 含量为评价指标，对菌株29B 产IAA 能力进行条件优化。结果表明，菌株29B 最佳培养条件是初始pH 值为7.0，接种量（体积分数）为2%，35℃摇床培养108h 。在此最优条件下，菌株29B 的IAA 产量可达138.87μg /mL ，比优化前提高153.74%。研究结果为菌株29B 在农业生产中的应用提供了实验基础和理论依据。关键词
吲哚乙酸（IAA ）；筛选；条件优化；堆肥
中图分类号
Q939.9
文献标识码
A
文章编号
2095⁃1736（2021）02⁃0065⁃05
Screening ，identification and culture condition optimization of
an indole-3-acetic acid producing bacterial strain
ZHOU Mingdian 1，2
，C AI Guanjing 1，N ING Jing 1，Z HU Gefu 1
（1.Institute of Urban Environment ，C hinese Academy of Sciences ，X iamen 361021，C hina ；
2.University of Chinese Academy of Sciences ，B eijing 100049，C hina ）
Abstract The indole-3-acetic acid （IAA ）-producing strains were preliminarily screened by using spread plate and Salkowski colori⁃
metric method ，a nd quantitative analysis of spectrophotometry was used to rescreen the strain with high IAA producing capacity.Three IAA-producing strains were isolated from the compost sample ，a nd strain 29B showed the highest IAA productivity with the yield reached 54.73μg /mL in 96h of cultivation.Based on morphological observation ，p art of physio-biochemical characteristics and analysis of 16S rDNA gene sequences ，t he strain 29B was identified as Corynebacterium stationis .The single factor tests were de⁃signed to optimize the IAA production of strain 29B.Results showed that the optimum culture conditions were as follows ：initial pH value ，7.0；i noculum amo
unt （volume fraction ），2%；s haking culture at 35℃for 108h.Under the optimal culture conditions ，t he yield of IAA reached up to 138.87μg /mL ，w hich was increased by 153.74%compared with that before optimization.These results would provide an experimental and theoretical basis for the application of strain 29B in agricultural production.Key words indole-3-acetic acid （IAA ）；screening ；optimization ；compost
吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid ，I AA ）是一种重要
的植物生长激素，对植物的新陈代谢、生长发育都起着
开关量信号重要作用［1］
。IAA 除了能由植物体少量合成之外，还能被特定功能性微生物代谢所产生。自1979年Tien 等［2］发现巴西固氮螺菌可以合成IAA 以来，大量IAA 产生菌被研究人员从自然环境中分离出来，其中以固 氮螺菌属（Azospirillum sp.）、链霉菌属（Streptomyces
sp.）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、假单胞菌属（Pseudo⁃
monas sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）等为主［3-5］。IAA 产生菌作为重要的微生物资源，可以通过产生促生长的活性物质来影响新陈代谢，刺激植物生长，国内
外在分离和利用功能菌等方面有诸多报道［6］
。因此，继续筛选和分离具有产IAA 功能的微生物仍是农业微生物学研究的基本内容和重要工作之一。
收稿日期：2020-03-12；最后修回日期：2020-04-15
基金项目：国家自然科学基金项目（51678553、21876167、21477122）；国家重点研发计划项目（2018YFD0500202-04）；福建省自然科学基
金项目（2019J05161）
作者简介：周铭典，硕士研究生，专业方向为农业生物质废弃物利用，E ⁃mail ：************* 通信作者：朱葛夫，博士，研究员，研究方向为厌氧功能微生物及其利用，E ⁃mail ：************
65
目前，已发现的IAA产生菌主要来源于植物表面、作物根际土壤和海洋环境等，如胡泽瑞等［7］从三
叶鬼针草内分离到高产IAA的固氮芽孢杆菌，张振［8］从植物根际土壤中分离得到IAA产生菌。然而，关于从堆肥中分离IAA产生菌的研究尚鲜有报道。堆肥作为农业生物质废弃物（畜禽粪便和剩余秸秆等）无害化和资源化处理的重要手段，其体系内的微生物种类繁多且种更迭迅速［9］。由于IAA产生菌对分离来源具有较高环境适应潜力和定植能力［10］，故从堆肥中筛选具有产IAA能力的微生物对堆肥生物菌剂的研发与利用具有重要意义。本研究从猪粪堆肥体系中分离出1株高产IAA菌株29B，对其进行了分类鉴定，并利用单因素试验对菌株培养条件进行优化以提高IAA产量，为合理开发利用该菌提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
供试样品取自福建省厦门市城市环境研究所科研温室内一处猪粪堆肥堆体内，样品采集于灭菌袋中，带回实验室后置于冰箱4℃保存，并于48h内完成分离培养。
1.1.2主要试剂
L-氨酸（纯度>99%）和IAA分析标准品（纯度> 99.9%）购于aladdin公司；16S rDNA引物由上海捷
瑞生物工程有限公司合成；扩增试剂盒购自TaKaRa公司；其他试剂均购自国药控股股份有限公司。
1.1.3培养基
LB液体培养基（g/L）：胰化蛋白胨10.0，酵母提取
物5.0，氯化钠10.0，p H值调至7.0~7.2，121℃灭菌20min。LB固体培养基（g/L）：琼脂粉20.0，其余同LB
液体培养基。含L-氨酸的LB液体培养基：配置高浓度L-氨酸母液，使用细菌过滤器将母液注入LB 液体培养基中，使得培养基中L-氨酸终浓度为3 mmol/L。
1.1.4主要仪器
OHAUS-CP224C电子天平、AIRTECH SW-CJ-1FD
洁净工作台、LDZX-50KB-II立式压力蒸汽灭菌器、TENSUC LRH-250F生化培养箱、TS80C恒温摇床、Sartorius PB-10酸度计、HERMLE Z216MK高速离心机、T960热循环仪、ONLAB EU-2600扫描型紫外可见分光光度计、Hitachi S-4800场发射扫描电子显微镜。
1.2IAA产生菌的筛选与鉴定方法
1.2.1IAA产生菌定性初筛
称取10g堆肥样品于250mL锥形瓶中，加入100 mL无菌水后于120r/min摇床中振荡20min，静置10 min后滤去杂质，可得到质量浓度为0.1mg/L的菌悬液。用无菌水将菌悬液梯度稀释至10-1~10-9mg/L，然后将10-5~10-8稀释度的菌液涂布至LB固体培养基上，放置于30℃恒温箱中培养2d。挑取不同类型的单菌落，制成单菌落的LB固体培养基（斜面）置于4℃冰箱
中保存待用。
采用Salkowski比法对IAA产生菌进行筛选。
活化单菌落斜面上的细菌，接种于LB液体培养基中，
在30℃、120r/min的摇床中振荡培养。按2%（体积
分数）接种量取处于对数生长期的上述菌悬液（1.0×108~1.0×109CFU/mL）接种至含L-氨酸的LB液体培养基中，在30℃、120r/min的摇床中振荡培养96h。
取50μL菌悬液滴于96透明孔板中，加入等量Salkows⁃ki显试剂（1mL0.5mol/L FeCl3与50mL35%HClO4
混合）［11］，并以IAA标准溶液作为阳性对照。将96透明孔板置于室温下避光放置30min，观察到颜变成粉红则表示菌株具有产IAA能力。
1.2.2产IAA能力定量复筛
试验参照Apine等［12］的IAA浓度测定方法。取2 mL菌悬液，8000r/min离心5min，加入等量Salkowski
试剂后置于室温避光处，30min后用紫外可见分光光度计于波长530nm处测定其吸光度。对照标准关系曲线计算单位体积发酵液中IAA含量，从中筛选出产IAA能力强的菌株。标准关系曲线通过梯度稀释IAA 分析标准品绘制。
1.2.3菌株鉴定
形态学观察。将菌株在固体LB培养基上划线，放置于30℃生化培养箱中培养48h。观察其在固体培养基上形成的菌落形状、颜、表面质地以及边缘等形态特征。用戊二醛对菌体进行固定，经酒精梯度脱水、二氧化碳临界点干燥和喷金等处理后，使用场发射扫描电子显微镜对其进行观察拍照。生理生化特征鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》（第8版）进行生理生化鉴定［13-14］。分析生物学鉴定。采用煮沸法提取DNA。取1mL菌液，置于4℃，7000r/min离心5min；
倒掉上清液，用1mL生理盐水重溶沉淀，该步骤重复2次；用100μL蒸馏水重溶沉淀，振荡均匀后置于100℃沸水中煮沸5~10min；取出后置于4℃，10000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。采用细菌16S rDNA通用引物27F／1492R （正向引物：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；反向引物：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）进行PCR扩增。PCR反应在50μL体系中进行：Premix Taq （TaKaRa Taq Version2.0plus dye）25μL，d dH2O15μL，正向引物和反向引物（10μmol/L）各2.5μL，D NA 模板5μL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃再延伸10min。扩增产物送往上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序结果在EzBioCloud数据库中进行同源性分析，并选出同源性高的菌株的16S rDNA 序列用MEGA7.0软件构建系统发育树。
1.3菌株29B产IAA的条件优化
试验以培养液中IAA含量为评价指标进行单因素优化试验，考察因素有培养时长、初始pH值、接种量及培养温度，每个处理设置3个平行样。
66
1.3.1培养时长将处于对数生长期的菌悬液按2%（体积分数）接种量接种至含L-氨酸的LB液体培养基中，置于摇床30℃、120r/min条件下振荡培养。在24、36、48、60、72、84、96、108、120、13
2、144、156和168 h破坏性取样，按照定量测定方法检测IAA含量，确定最佳培养时长。
1.3.2初始pH值将含L-氨酸的LB液体培养基的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按2%（体积分数）接种量接种处于对数生长期的菌悬液，置于摇床30℃、120r/min条件下振荡培养108h，按照定量测定方法检测IAA含量，确定最佳初始pH值。1.3.3接种量将处于对数生长期的菌悬液按不同接种量（体积分数，1.0%、
2.0%、
3.0%、
4.0%、
5.0%和10.0%）接种至含L-氨酸的LB液体培养基中，置于摇床30℃、120r/min条件下振荡培养108h，按照定量测定方法检测IAA含量，确定最佳接种量。
1.3.4培养温度将处于对数生长期的菌悬液按2%（体积分数）接种量接种至含L-氨酸的LB液体培养基中，调整摇床温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，于120r/min条件下振荡培养108h，按照定量测定方法检测IAA含量，确定最佳培养温度。
2结果与讨论
蜂衣
2.1IAA产生菌的筛选与鉴定
2.1.1菌株筛选
从猪粪堆肥样品中共分离出89株细菌，利用吲哚乙酸与Salkowski试剂反应呈粉红，初步筛选出编号为29B、33C和YZ的菌株具有产IAA能力。对上述菌株进行IAA产量定量测定，并通过标准关系曲线换算得到菌株29B、33C和YZ的IAA产量分别为54.73、39.18和16.32μg/mL。将本试验分离的菌株与文献中报道的IAA产生菌进行比较（表1），发现菌株29B产IAA能力高于孙雪等［3］从盐碱地以及田会会等［15］从重金属污染土样中分离得到的IAA产生菌，略低于张振［8］从植物根际土壤中分离得到的IAA产生菌。此外，菌株YZ产IAA能力为3株菌中最低，菌株33C低于菌株29B，故最终确定菌株29B为研究对象。
表1其他分离来源的IAA产生菌产量
Table1Yield of IAA-producing bacteria from other sources
菌株
Strains
Halomonas aquamarina DB01 Proteus vulgaris TK-2 Providencia rettgeri WM-1 Arthrobacter pascens ZZ21
Bacillus flexus A60 Burkholderia gladioli JF-8
29B
33C
YZ 吲哚乙酸产量/
（μg/mL）
IAA production
8.97
13.84
22.54
59.81
29.17
57.48
54.73
39.18
16.32
分离来源
Sources
盐碱地
重金属污染土样
重金属污染土样
植物根际土壤
植物根际土壤
三叶鬼针草
猪粪堆肥物料
猪粪堆肥物料
猪粪堆肥物料
参考文献
References
［3］
［15］
［15］
［8］
［16］
［7］
*本试验分离
*本试验分离
程控步进衰减器系统*本试验分离
2.1.2菌株鉴定
3d蓝光播放器形态学观察。由图1（a
）
可知，菌株29B在LB固体培养基上形成的菌落为淡黄隆起，近圆形，表面光
滑，边缘整齐。通过扫描电镜观察发现，菌体呈棒杆状，具体见图1（b）。
（a）（b）
图1菌株29B菌落形态（a）和扫描电镜图（b）
Figure1The colony morphology characteristic（a）and
morphological features（b）of strain29B
生理生化特征鉴定。部分生理生化指标如表2所示。
表2菌株29B生理生化特征
Table2Physiological and biochemical properties of strain29B
鉴定指标
Identification index
革兰氏染
过氧化氢酶
硝酸盐还原
吲哚
葡萄糖酸盐
硝基-β-D甲基半乳糖利用
阿伯糖利用
甘露糖利用
N-乙酰葡萄糖胺利用
柠檬酸盐利用
结果
Results
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应
分析生物学鉴定。对菌株29B的16S rDNA进行PCR扩增，产物测序后获得长度为1436bp的序列。
将菌株29B的16S rDNA基因序列在EzBioCloud数据库中进行序列比对，发现菌株29B与停滞棒杆菌D
SM 20302（Corynebacterium stationis DSM20302）序列相似度最高，达到98.67%。根据对比结果选取近缘菌株构建系统发育进化树（图2），在进化树上菌株29B与Co⁃rynebacterium stationis DSM20302位于同一支。此外，模式菌株Corynebacterium stationis DSM20302的特征为革兰氏阳性菌，菌体呈短棒状，直径为0.6~1.0mm，可单个、成对或呈V字形排列，过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原试验阳性，不产生脱氧核糖核酸酶和吲哚，可碱化柠檬酸，可与葡萄糖缓慢反应产生酸，与甘露糖反应弱，与木糖、甘露醇、乳糖、半乳糖、麦芽糖和甘油等不反应［17］。将表2中菌株29B的生理生化特征与模式菌株进行两两比对，可以发现除吲哚试验与柠檬酸盐利用试验结果不同外，菌株29B的其他鉴定指标与模式菌株特征记录一致，造成这一差异的原因可能与基因序列非完全一致及菌株分离生境有关。特别值得注意的是，菌株29B吲哚试验呈阳性表明其能分解氨酸生成吲哚，符合本试验中菌株29B具有产IAA能力的特征。结合以上信息，将菌株29B鉴定为停滞棒杆菌（Corynebacterium stationis），并于2019年11月25日保智能交通信号灯
67
藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19005。
菌株安全性。棒状杆菌属（Corynebacterium ）细菌种类较多，其中白喉棒状杆菌有致病性可引起白喉，类白喉杆菌如假白喉棒状杆菌、痤疮棒状杆菌、结膜干燥杆菌等为非致病菌。目前，停滞棒杆菌
（Corynebacteri⁃um stationis ）无致病性报道，且Bernard 等［17］研究发现Corynebacterium stationis DSM 20302（=ATCC 14403）不存在白喉毒杆菌基因，可初步判定菌株29B 不具有致病性。此外，同种
属菌株Corynebacterium stationis ATCC 6872因有很强的三磷酸腺苷再生活性和能提供足够的磷酸核糖焦磷酸，一直以来被广泛应用于核苷酸的工业生产中，且尚无生物安全性疑虑相关报道，但日后进一步开发利用菌株29B （如微生物菌剂研发、生物有机肥等）仍需进行全面的体外安全性评估。
图2菌株29B 基于16S rDNA 序列的系统发育树
Figure 2Phylogenetic tree of strain 29B based on 16S rDNA sequences
2.2菌株29B 产IAA 条件优化
2.2.1培养时长对菌株29B 产IAA 的影响
由图3可知，培养基中IAA 含量在前108h 不断增加，在84~108h 的IAA 含量增长率最快，并于108h 达到峰值81.42μg /mL 。此后，I AA 含量开始下降，在132h 的IAA 含量仅为峰值的51.57%。IAA 含量随时间增长先上升后下降的变化趋势与郑文波等［18］试验结果一致。造成该现象的原因可以从两个方面解释：一方面IAA 为氨酸代谢产物，细胞进入稳定期后会产生大量次生代谢产物，所以IAA 含量随时间增加而显著升高。随后细菌进入衰亡期，培养基中营养物质及氨酸被消耗殆尽且其他有害代谢产物不断积累，细菌生长速度放缓、死亡数增多，其生理代谢活动趋于停滞不再产生IAA 。另一方面，前人研究表明过氧化物酶类能降解IAA ，且Zhu 等［19］发现随着IAA 含量增加，I AA 会与过氧化氢酶结合形成复合体。由过氧化氢酶试验呈阳性，可知菌株29B 能产生过氧化氢酶，故IAA 被消耗会呈现下降趋势。
2.2.2初始pH 值对菌株29B 产IAA 的影响
由图4可知，培养基初始pH 值在6.0~8.0时，菌株29B 具有较高的IAA 产量，并在pH 7.0时达到76.30μ
g /mL 。随着初始pH 值继续升高，I AA 产量呈下降趋势，在pH 9.0时约为峰值的一半。在初始pH 值为4.0
时，I AA 产量最低仅为4.49μg /mL 。该结果与江绪文
等［5］从藿香体内分离出的IAA 产生菌的pH 值范围一致，而不同于Chandra 等［20］从植物根际土壤中筛出菌株在pH 9.0时IAA 产量才达到最高。造成该现象一方面是因为菌株分离来源不同，菌株29B
适宜的pH 值范围与堆肥过程中pH 波动范围一致；另一方面，p H 值会影响菌株对营养物质的吸收、利用能力以及代谢酶活性，由于不同细菌种属对pH 值耐受能力不一样，故会造成产IAA 能力的差异。
图3不同培养时长对菌株29B 产IAA 的影响
Figure 3Effects of different culture duration on IAA secretion of strain 29B
图4不同初始pH 值对菌株29B 产IAA 的影响
Figure 4Effects of different initial pH on IAA secretion of strain 29B
2.2.3接种量对菌株29B 产IAA 的影响
由图5可知，当接种量为2%时，菌株29B 产IAA 能力最强。当接种量大于2%并继续增加时，I AA 含量发生明显下降。造成该现象的原因是菌株29B 为好氧菌，在提高接种量而含氧量不变的情况下，菌体成倍繁殖会造成培养基黏度增大，从而影响菌株生长。此外，I AA 合成为好氧代谢过程，培养基在缺氧时不利于
菌株产IAA ［18］
。当接种量增至10%，菌液中的IAA 含量并未似预期降为最低，反而出现了小幅升高。这可能与菌株大量繁殖并在接种前期积累了大量IAA 有关，但随着氧气被快速消耗，I AA 不再合成甚至被末端氧化酶等降解导致含量降低。
2.2.4培养温度对菌株29B 产IAA 的影响
由图6可知，菌株29B 在培养温度为20℃~35℃时，I AA 产量随温度升高而增加。在培养温度为35℃时，I AA 产量最高可达138.87μg /mL ，比未优化前的产量提高了153.74%。当温度高于40℃时，I AA 产量急速下降，在45℃时降至9.09μg /mL ，与峰值相比降低了93.46%。试验结果表明菌株29B 的最适培养温度为35℃，对40℃及以上高温敏感。此外，通过比较前述单因素试验结果可知，优化培养温度对菌株29B
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产IAA能力的影响最为明显。造成该现象的直接原因可能与温度影响细胞内酶的代谢活动有关，随着温度升高产IAA相关酶活性会逐渐增强，到达最适温度后继续升高，则会导致酶活性降低甚至失活，从而直接影响菌株分泌IAA能力。
图5不同接种量对菌株29B产IAA的影响Figure5Effects of different inoculation amounts on IAA secretion of strain29B
图6不同培养温度对菌株29B产IAA的影响Figure6Effects of different temperature on IAA secretion of strain29B 3结论
本试验从猪粪堆肥体系中筛选获得一株产IAA能力较强的菌株29B，通过生理生化试验以及16S rDNA 序列比对，将菌株29B鉴定为停滞棒杆菌（Corynebacte⁃rium stationis）。菌株29B产IAA的最佳培养时间为108h，最佳初始pH值为7.0，最佳接种量（体积分数）为2%，最佳培养温度为35℃。此外，I AA产生菌中鲜有停滞棒杆菌被报道，因此停滞棒杆菌29B的获得丰富了功能微生物的菌株资源，为后续微生物菌肥尤其针对猪粪堆肥中IAA产生菌的开发应用提供更多选择。
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