中华医学遗传学杂志
CHINA JOURNAL OF MEDICAL GENETICS
1999年 第16卷 第5期 vol.16 No.5 1999
Prader-Willi/Angelman综合征的分子遗传学
傅俊江 李麓芸
Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)和Angelman综合征(Angelman syndrome,AS)是两种临床上明显不同的神经遗传性疾病。PWS(MIM176270)的特点为：胎动减少，肥胖，婴儿期肌张力减退，智力障碍，身材短小，促性腺激素分泌不足的性腺机能减退和手足异常。AS(MIM105830)的特点是严重运动、智力障碍，共济失调，肌张力低下，癫痫，语言障碍和以巨大下颌及张口吐舌为特征的特殊面容。Bower 和Jeavons于1967年创造了名为愉快木偶综合征(AS)的疾病，称“安琪儿”(Angelman)。PWS和AS均为染体15q11-13缺陷，其发病率约为1/15 000。现对PWS、AS的分子缺陷类别与分子遗传学研究进展及其基因诊断综述如下。
1 PWS和AS的分子缺陷类别
1.1 缺失 约70%的PWS及AS患者均发现有染体15q11-13的缺失。PWS为父源染体15q11-13的缺失、母源基因不表达，而AS为其母源染体15q11-13的缺失、父源基因不表达。
1.2 单亲二体(uniparental disomy, UPD) PWS和AS患者的两条15号染体均正常，但PWS患者的两条15号染体均来自母亲，即母亲单亲二体(UPD)；而AS患者的两条15号染体均来自父亲，即父亲单亲二体(UPD)。PWS的UPD发生率较普遍(25%)，而AS 的较低(2%)。
1.3 印迹突变 印迹，也叫基因组印迹或遗传印迹，指源自双亲的子代等位基因的差异表达。印迹突变是在世代传递过程中，由于控制印迹的基因发生突变导致在配子形成中发生重新设定和转换失败。约5%的PWS和AS患者虽然从双亲各遗传了1条15号染体，但是它们在印迹的染体15q11-13区域呈现异常DNA的甲基化和基因表达，提示这类患者在自身的印迹过程中发生了突变。其中的一半(包括家族性的)为微缺失，PWS缺失的共同最小区域在SNRPN基因的第1外显子(4kb)，而AS在SNRPN基因的第1外显子的上游(2kb)，从而确定这类患者为印迹中心(imprinting center, IC)发生突变——印迹突变引起。PWS的共同缺失区与AS的并不重叠，因此认为IC具有双重结构［1，2］。为何印迹突变导致沿15q11-13区域呈现异常DNA的甲基化和基因表达，目前并不清楚。但有人提出顺式作用的父母一方基因组的“遗传外标记”(epigenetic mark)被甲基化，从而调节增强子与哪一个启动子结合的“增强子- 竞争”(enhancer competition)模型［1-3］。也可能在配子形成中，IC和SNRPN基因的启动子元件对于在控制双亲印迹在15q11-13的重新设定和启动印迹转换中起了重要的作用。
遗传印迹与DNA的甲基化有关。探讨PWS和AS在印迹转换过程中突变，不仅对于了解15q11-13区域印迹的分子机理，而且对于了解染体其它区域，如各种肿瘤及Beckwith-Wiedeman syndrome (BWS)的印迹突变的分子机理都是有帮助的。
在生命世代的循环过程中，印迹在每一代都必须进行转换和在发育的生殖细胞中进行重新设定，只有这样才能保证不同性别的个体特异地发生父系或母系印迹。当母源印迹突变通过男性传递，母源表基因型(epigenotype)如果不能在男性精子中重新设定为正常父源表基因型，则阻碍了从母源到父源(mat→pat)的印迹转换，因而将母源印迹传递给他的半数配子，所生的后代基因型除了遗传正常的母源表基因型外还从父亲那儿遗传了异常配子的表基因型。这样所生的后代是母源表基因型的纯合子，因而产生了PWS；同样，当父源印迹突变通过其女儿传递时发生印迹转换失败，从而患者从母亲那儿遗传了异常的父源表基因型，导致其后代是父源印迹的纯合子，因而产生了AS。对于这些PWS和AS，突变并不会直接影响其本人，而是突变阻碍了双亲配子发生祖辈印迹转换，其后果是半数后代致病。这是家族性PWS和AS的印迹突变为何能在同性后代中默默传递不致病、而在异性后代中传递就发病的根本原因。这是一种全新的遗传疾病发病机理［1-4］。
1.4 基因突变 过去认为PWS和AS均是由于染体微缺失而引起的邻近基因综合征，而不是单个基因异常引起的。但发现有20%的AS患者既无15号染体的缺失，也无UPD和印迹突变，而是基因突变。Kishno和Matsuura等在4例AS患者中检测到UBE3A基因突变，其中包括一个新生的5bp的重复，一个2bp的缺失，导致框架移动；一个由母亲遗传的剪切突变，导致转译提前终止和一个错义突变［5，6］。
UBE3A基因定位在PWS及AS所在的15q11-13区域，它至少含有16个外显子，覆盖的基因组约120kb，转录方向是从端粒至着丝粒，其mRNA大小为5-8kb，由于选择剪切作用而至少有5个以上的转录本，编码区约2.6kb［7］。人和小鼠的研究表明，UBE3A基因仅在脑中发生特异性印迹［8］，至于为何在脑中缺乏UBE3A蛋白就出现AS的临床症状目前还不清楚。UBE3A编码一种遍在蛋白-蛋白质连接酶，它的功能是识别遍在蛋白转移的底物的特异性并且直接催化遍在蛋白转移到底物上［9，10］。
目前，人们仍未在PWS患者中检测到某个基因的突变，不过在15q11-13区域鉴定了仅父源染体表达的基因至少7个(SNRPN,ZNF127,NDN,IC,PAR5,PAR1,IPW)和多个EST［4］。印迹中心
图1 Prader-willi和Angelman综合征的分子类别
P：父源性染体；P(M)：因IC突变而具有固定母本表基因型的父源性染体；M：母源性染体；
M(P)：因IC突变而具有固定父本表基因型的母源性染体
图2 由胞嘧啶转换成尿嘧啶的亚硫酸氢基反应流程图
第1步胞嘧啶硫化作用而成为硫化胞嘧啶；第2步硫化胞嘧啶水解脱氨而成为硫化尿嘧啶；第3步硫化尿嘧啶碱性脱硫而成为尿嘧啶(IC)突变的小鼠模型研究证明，SNRPN基因内缺失鼠表型正常，表明SNRPN基因突变并不能足以使鼠患PWS；而大片段缺失，包括SNRPN基因和推定的鼠IC缺失则表现出类似PWS患儿的严重表型［11］。因而认为PWS与AS不同，即可能不是单基因病，而是节段非二倍体综合征(segmental aneusomy syndrome, SAS)或俗称的邻近基因综合征［12］。
除此之外，还有极少数患者为染体平衡易位等(图1)。
2 PWS和AS的基因诊断
PWS和AS最常见的细胞遗传学异常为15q11-13缺失，极少数为染体易位、倒位、重复等。当临床疑为PWS或AS时，则可做550条带以上的高分辨染体检查，以辨别各种类别的染体畸变。而对于高分辨染体检查也不能发现的染体更微小的缺失及如上所述的各种分子缺陷类别的异常，则只有通过更加有效的技术：FISH和分子遗传学技术进行诊断和产前诊断。
2.1 15q11-13缺失的检测 大约有70%的患者均发现有染体15q11-13的缺失，而覆盖该区域的各
种DNA克隆，如YACs、PACs、Cosmids已经有了，因而应用这些染体单一序列(USP)探针进行FISH，能够快速有效地检测该区域的缺失，甚至高分辨染体显带技术未能发现的微缺失。同时具有在间期核中即可检测是否存在缺失的优点。Ligon
等［13］成功地应用鉴定SNRPN位点的Comsids c102和c106及其它一些克隆子，作为探针进行M-FISH来检测包括PWS及AS和其它SAS或微缺失综合征患者的缺失。
2.2 DNA甲基化检测 对于缺失、UPD和印迹突变，均导致相关染体15q11-13区域DNA的异常甲基化，检测15q11-13区域DNA的异常甲基化是PWS和AS基因诊断检出率最高的一种方法。
悬式绝缘子2.2.1 Southern blotting分析 SNRPN基因是最早发现，并且被认为是PWS的最佳候选基因。也是最佳Southern blotting分析的基因［14］。它包含有两个被DNA甲基化印迹区域：外显子1，表达的父源等位基因非甲基化而沉默的母源等位基因甲基化；内含子7，父源等位基因甲基化而母源等位基因非甲基化。具体方法是，用DNA甲基化敏感的酶如Not I及另外一种酶如XbaI双酶完全消化基因组DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，Southern转移到尼龙膜上，同位素标记的SNRPN基因外显子α片段与尼龙膜进行杂交，放射自显影，PWS患者仅出现4.2kb父源杂交带，AS患者仅出现0.9kb母源的杂交带，而正常人则4.2kb和0.9kb杂交带均出现，从而对PWS及AS进行准确的诊断和产前诊断［15］。但是在使用该法的时候需要将基因组DNA完全消化，否则会出现额外的杂交带，影响结果分析。其解
决办法是使用包含有载体多克隆位点上NotⅠ的DNA作为内对照，以证实是否消化完全。使用该法的优点是诊断结果可靠，可用于培养的羊水和绒毛的产前基因诊断［14］。其缺点是需要DNA量多、需要使用同位素、操作繁琐。
2.2.2 甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)检测 在推定的SNRPN基因启动子区含有CpG岛，该区域上父源等位基因甲基化而母源等位基因非甲基化。在PWS患者中仅存在甲基化的等位基因，而AS患者中仅存在非甲基化的等位基因，因而可以应用MS-PCR来检测SNRPN基因CpG岛的甲基化状态，对PWS及AS进行快速诊断［15］。其原理是：化学试剂如亚硫酸氢钠将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而SNRPN基因CpG二核苷酸上的胞嘧啶因甲基化而不变(图2)［16］。基于这种差异性，设计两对特异性的引物：一对甲基化特异性引物(MET)和一对非甲基化特异性引物(UNMET)，就可将甲基化等位基因化学修饰的DNA序列与非甲基化等位基因区分。化学修饰的PWS患者DNA仅MET引物扩增，而化学修饰的AS患者仅UNMET引物扩增；化学修饰的正常人DNA则两对引物均扩增。由此可对几乎全部PWS和大约80%AS患者进行快速有效的基因诊断和产前诊断［14］。
2.3 基因点突变的检测［5，6，17］ UBE3A基因突变导致AS［5，6］。UBE3A的基因组结构、内含子外显子交界及外显子编码序列已清楚，因此扩增整个编码序列进行基于PCR的DNA点突变检测已成为现实［7，17］。Malzac等［17］应用PCR-SSCP技术分析AS 患者的UBE3A的基因突变，他
们在35例散发性病例中发现了5例(14%)，而在10个家族性病例中发现了8例(80%)。对于基因点突变的检测，除了上述常用的SSCP技术外，还可应用检测基因突变的其它方法，如DGGE、异源双链分析等进行。
2.4 连锁分析 应用15号染体上的微卫星标记进行染体UPD连锁分析［18］以控制PWS和AS患儿的出生。
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除此以外，还可从RNA或蛋白质水平进行检测。
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3 展望
PWS及AS的15q11-13基因组印迹是非孟德尔遗传的典型，深入研究PWS和AS遗传印迹为研究其它一些与印迹相关的遗传病、肿瘤提供了一种新的线索，为研究印迹基因表达机理提供了独特的模式系统。吸引了广大科技工作者继续深入地研究，并为基
晾衣叉因诊断提供了崭新的诊断策略和方法，最终为人类优生服务。
作者单位：410078 长沙，湖南医科大学生殖工程研究室
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