m6A甲基化研究指南将从m6A是什么，m6A甲基化酶的种类及功能，m6A检测⽅法汇总，m6A课题设计思路，m6A论⽂发表梯度推荐，m6A后期验证⼯具⼤全到经典案例解析等⽅⾯为⼤家揭开m6A的神秘⾯纱，每天5分钟，就能从m6A⼩⽩⼊门到⾼阶提⾼哦~
验证⼯具⼤全到经典案例解析
今天的⽂章将围绕RNA甲基化m6A实验开展中⼏个重要的阶段进⾏介绍，⼀起来学习吧~
有很多⽼师和同学上次在后台留⾔说上⾯这张流程图，也就是m6A实验整体思路的流程图还是太复杂太抽象，不好理解。今天我们会来带领⼤家如何⼀ 今天我们会来带领⼤家如何⼀步步开展⾃⼰的实验，⾝临其境地去体验m6A实验的每个阶段所要完成的步骤。
这篇⽂章会⽐较“啰嗦”和冗余，⽬的在于帮助刚踏⼊科研的同学们快速梳理⾃⼰的思路。如果⽼师有新的见解，也欢迎提出⾃⼰的想法与意见。
阶段⼀：了解什么是RNA甲基化
例如⼩陈是基础医学院直博⼆年级的研究⽣，研究⽅向为新型肿瘤药物。有⼀天⼩陈被导师喊去谈谈话交交⼼，导师语重⼼长地和⼩陈说RNA甲基化最近很⽕，让他看⼀下这个⽅向是否可以做⼀些尝试。
对于⼩陈⽽⾔，⾸先他要了解什么是RNA甲基化。简单地资料搜索后，他从Pubmed上下载了芝加哥⼤学何川教授和康奈尔⼤学Jaffrey教授撰写的相应综述，并对综述进⾏了详细阅读。因为这⼏位教授都是研究RNA甲基化的⼤⽜，通过他们撰写的⾼质量综述可以避免很多弯路。
仔细研读综述后，⼩陈了解到RNA甲基化中的m6A⾸先在甲基化转移酶的作⽤下对RNA上的腺嘌呤（
A）进⾏m6A修饰，再在去甲基化酶的作⽤下对已发⽣m6A修饰的RNA进⾏去甲基化修饰。最后发⽣m6A修饰的RNA通过被甲基化阅读蛋⽩识别后，⾏使下游的⼀系列功能，包括miRNA加⼯、mRNA出核翻译及剪切等。
下⼀步，⼩陈对⼏种参与RNA甲基化的酶进⾏了系统整理，将其分为Writers、Erasers和Readers。并将这些功能做了⼀个⼤致的罗列。
备注：整体时间花费在3-7天，推荐需要阅读和⼊门的参考⽂献：
Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A Readers, Writers, and Erasers. Annual Review of Cell & Developmental Biology, 33(1), 319.
六类网线做法Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. (2014). Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 15(5), 293-306.
Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187.
阶段⼆：研究他⼈的课题思路，确定⾃⼰的课题⽅向
在对RNA甲基化进⾏初步扫盲后，就要进⼊下⼀步的研究了。这时候，需要开始⼤量的阅读m6A相关论⽂了，尤其是⼀些Research articles。这时候也要对经常在⾼分杂志屠榜的⼏个研究m6A的课题组烂熟于⼼。熟读他们的论⽂之后，还需要琢磨发⾼分的原因究竟在哪⾥？
通常来说，如果循着⾼⼿的⾜迹，对其实验思路进⾏me too似的修改，如换实验对象、换材料甚⾄是更换药物，充其量只能算是⼀篇copy论⽂，通常影响因⼦会下降不少，但是费⽤开销反⽽会增加不少。例如⼀篇PNAS或者NAR上发表的论⽂，如果按照其思路进⾏me too似的copy，⽂章档次会被卡死
在6分左右。⽽6分左右的套路沿袭到⾃⼰⾝上，那么4分都很危险。
情趣口香糖
看到这张图请不要过于兴奋，尤其是miRNA抑制酶的转录⽔平，这种思路基本属于创新性较差的⽅向。⽽甲基化相应的酶调控miRNA就属于⽐较新的⽅向。其他的所有“套路”基本包含在这个流程图内。⼀切准备就绪后，就可以正式开启⾃⼰的RNA甲基化实验之旅啦！
阶段三：开启测序前的⼀些“预实验”
网联网
阶段三所有实验为可选项，⽼师也可以跳过这部分直接进⼊测序部分，来挖掘哪些基因在甲基化修饰上产⽣了差异。
①到差异writers、erasers和readers或者检测整体m6A⽔平
⾸先，还是要到与RNA甲基化相关的酶是否有差异表达。既可以是药物处理前VS药物处理后，也可以是肿瘤组织VS癌旁组织，甚⾄是发育的时间顺序，⾮模式⽣物不同的组织器官做⽐较也是考虑的研究⽅向。 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）
如上图所⽰，作者对肝癌组织、癌旁组织以及正常组织中⼏种常见的酶都进⾏了qPCR验证，发现FT淀粉酶抑制剂
O和METTL14有差异表达。
另外通过GWAS以及各种⼈⼤队列分析得到的易感基因正好和RNA甲基化有关，那么这项课题开展下去的意义会更⼤。这时候RNA甲基化被赋予了新的⽣命，是上游课题的延续。即全基因组重测序
即全基因组重测序/全外显⼦测序/靶向捕获测序→SNP和Indel分析→GWAS→易感基因→细胞实验/动物实验→下游通路和最终表型，整个课题会完整会丰满。
分⼦机制→最终表型
（Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）
另⼀种省钱的⽅式就是从已发表的芯⽚数据中，直接挖掘⼏种酶是否有差异表达。如上图所⽰，何川
教授和陈建军教授合作发表在Cancer Cell上的论⽂，前期就是从⽹上队列数据中筛选出FTO基因才继续进⼊下游的细胞实验和动物实验。
⾄于检测m6A整体⽔平，可采⽤LC-MS/MS或酶标仪⽐⾊法的⽅式进⾏。在医院酶标仪相对于LC-MS/MS普及程度更⾼，可采⽤EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit的试剂盒直接进⾏检测，⽅便快捷。
（Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）
如上图所⽰，作者对肝癌组织、癌旁组织和正常组织在酶标仪上进⾏了m6A整体的⽔平检测后发现，肝癌组织m6A整体⽔平最低，⽽正常组织中m6A⽔平最⾼。
此外，⽼师在细胞中对⼏种酶进⾏敲低和过表达后，也可以选择使⽤酶标仪来检测整体的m6A⽔平是否发⽣变化。 ②甲基化酶敲低和过表达细胞实验
这⾥对⼏种已检测的甲基化酶进⾏敲低或过表达，当然这⼀步⽼师也可以在⼀开始直接进⾏。之后观察细胞表型和动物表型，建⽴起相关性关系。通常细胞实验⽐较容易开展，⽼师可以开始进⾏对应敲低/过表达体系的建⽴。
（Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）
如上图所⽰，在急性髓细胞⽩⾎病AML中，FTO存在表达量显著上升现象。作者在AML细胞系中，对FTO这个基因进⾏敲低和过表达后发现AML细
胞m6A整体⽔平降低，凋亡减少。敲低FTO趋势相反。
陶瓷刮刀③甲基化酶敲低和过表达动物模型实验卡盘扳手
（Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）
动物模型通常为可选项，⽼师可以根据⾃⼰的经费和实验整体设计来安排。如上图所⽰，作者在⼩⿏肿瘤模型中对METTL14进⾏敲低后发现肝癌转移能⼒增强。
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阶段四：m6A-seq挖掘靶基因
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