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铅对人Bel-7402肝癌细胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影响 吴家兵;杨永坚;王先良;叶丹;杨文静;钱岩;吕占禄;郭辰;梁豹
【摘 要】以体外培养人Bel-7402肝癌细胞为模型,研究铅的3种常见化合物氯化铅(PbCl2)、乙酸铅(Pb(CH3 COO)2)、硝酸铅(Pb(NO3)2)的细胞毒性和去甲基化表观遗传毒性.应用MTS方法检测细胞的存活率,以前期研究建立的评价方法评价铅化合物的去甲基化表观遗传毒性.结果显示,PbCl2、Pb (CH3 COO)2、Pb (NO3)2均会抑制Bel-7402细胞的增值,计算求得PbCl2、Pb(CH3 COO)2、Pb(NO3)2相应的50％细胞存活浓度(IC50)值分别为2 524 μmol·L-1、1 977 μmol·L-1、1 899 μmol·L-1;80％细胞存活浓度(IC80)值分别为264 μmol· L-1、221 μmol· L-1、281 μmol· L-1,通过对3种染毒物不同染毒浓度的细胞存活率进行随机区组设计的方差分析显示3种化合物间的差异无统计学意义(F=0.11;P=0.897).去甲基化表观遗传毒性检测结果显不,PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均可观察到明显的去甲基化表观遗传毒性,其相对于5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)的去甲基化表观遗传毒性当量分别为2.82E-03、1.50E-03、5.09E-04,三者间也无显著性差异.结果表明,铅化合物会使Bel-7402细胞的细胞存活率和转染进细胞的质粒上增强型绿荧光蛋白基因启动子的DNA甲基化水平下降.
车位管理系统【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2016(011)002
【总页数】7页(P708-714)
【关键词】铅;Bel-7402细胞;去甲基化;MTS
【作 者】吴家兵;杨永坚;王先良;叶丹;杨文静;钱岩;吕占禄;郭辰;梁豹
乙烯乙二醇
电视定制【作者单位】安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系,合肥230032;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012;安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系,合肥230032;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012;中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,北京100050;中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,北京100050;中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,北京100050;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012;安徽医科大学公共卫生学院
劳动卫生与环境卫生系,合肥230032;中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012
【正文语种】中 文
红兵打针
【中图分类】X171.5
Received 23 September 2015 accepted 28 October 2015
环境化合物引起的健康损害与表观遗传损伤关系密切，表观遗传毒性是化学品安全性评价的新问题[1]。研究发现许多通过现有安全性评价检测的化合物，没有发现存在基因突变、染体畸变等遗传学损伤能力，却依然可以通过表观遗传学机制对人类产生深远影响[2]。而铅作为环境中普遍存在的有毒重金属，可造成人体多种组织和器官的损害，低剂量接触就可引起各种亚临床改变如阿尔兹海默病[3]、精神发育迟滞等[4]。有研究显示我国儿童铅暴露所致精神发育迟滞的发病率远高于西太平洋地区的平均水平[5]。因此，评价铅及其化合物的表观遗传毒性是其安全性评价面临的新问题。近年来，随着检测技术的发展，国内外学者对铅暴露诱发的表观遗传学改变，特别是致DNA甲基化异常的研究取得了一些进展，
但对其致基因组DNA甲基化改变大小的定量评价还未见报道[6]。而不管是体内实验还是体外实验，了解环境化学物对于人类甲基化水平的作用能力大小，对丰富化学物的潜在毒性评价信息以及安全性评价体系的建立和标准的制定均有重要的参考价值。有专家已经开始认识到定量检测环境化合物去甲基化表观遗传毒性的重要性[7-8]。
本研究中我们选择了3种铅的常见化合物乙酸铅、硝酸铅、氯化铅为研究对象，以体外培养人Bel-7402肝癌细胞为模型。分别应用MTS方法检测细胞的存活率和通过前期研究建立的化学物去甲基化表观遗传毒性评价方法(简称QDMP)[9-12]检测其去甲基化表观遗传毒性，去甲基化表观遗传毒性评价结果以去甲基化药物5-Aza-CdR的浓度当量表示。该方法是将pEGFP-C3质粒通过人工甲基化处理，获得绿荧光蛋白基因启动子区处于高甲基化状态的C3质粒，并将其转染进人类Bel-7402肝癌细胞株，随后以该细胞株为载体，与染毒液进行共培养，依据细胞绿荧光强度来定量评价去甲基化功能的强弱，是对污染物表观遗传毒性评价技术的新探索。
1.1 仪器与试剂
主要仪器：BIO-PRINT008型凝胶成像系统(Vilberlo urmat，法国)；高速离心机(Sigma 3K
30 centrifuge，Sigma，美国)；流式细胞仪(Bechman Coulter Altra，美国)；水套式CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；生物安全柜(Thermo，美国)；Model680酶联免疫检测仪(Bio-RAD，美国)；IX71型荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；
主要试剂：Bel-7402细胞株和大肠杆菌DH5α感受态细胞由北京工业大学提供；Plasid maxi kit试剂盒(QIAGEN，美国)；DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Sigma，美国)；p-EGFP-C3质粒(Sigma，美国)；乙酸铅、硝酸铅、氯化铅(分析纯，中国西亚试剂公司)；DNA甲基化酶M.SssI、HpaII酶、MspI酶(New England Biolabs公司，美国)；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，美国)；500～7 500 bp DNA Marker(北京天根公司)。
1.2 铅化合物的细胞毒性检测
1.2.1 MTS实验
获取处于对数生长期生长良好的Bel-7402细胞，以每孔2×104个细胞接种于96孔板，每孔100 μL进行细胞铺板培养。移入细胞培养箱中以37 ℃、5% CO2条件培养，待细胞汇合度
达80%～90%时进行细胞染毒。将已配好的终浓度染毒溶液临用前超声5 min，用无血清培养基配制所需各浓度的染毒液于1 mL EP管中(根据预实验和相关文献[13-15]将染毒浓度定为0、50、100、200、400 μmol·L-1)，弃去培养板中原培养液，以100 μL每孔加入已配好的各浓度染毒液，每个染毒浓度设6个平行样，染毒培养24 h。细胞染毒结束前1 h以20 μL每孔加入MTS，而后用锡箔纸包好置于细胞培养箱内，继续培养1 h后用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测吸光度。
1.2.2 数据分析处理
对各染毒化合物进行MTS实验后，计算细胞存活率(细胞存活率=(OD实验组-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100%)。而后参考赵斌等[16]和王姗姗等[17]提到的方法，应用SPSS软件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的半数抑制浓度IC50和80%抑制浓度IC80。
1.3 铅化合物的去甲基化能力检测
1.3.1 高甲基化pEGFP-C3质粒的获取
(1) pEGFP-C3质粒的扩增：参照江艳等[18]使用的方法对质粒进行扩增。(2) pEGFP-C3质粒的提取：依据Plasid maxi kit试剂盒(QIAGEN)的操作说明对扩增好的质粒进行提取。(3) pEGFP-C3质粒的甲基化修饰及纯化：参照甲基化酶M.SssI说明书(New England Biolabs)对提取好的质粒进行甲基化修饰处理，并用HpaⅡ酶切检测甲基化修饰处理效果，未甲基化DNA双链的去除和甲基化DNA的纯化按照Wang等[19]和MicroElute DNA Clean-Up Kit试剂盒(OMEGA)的操作说明进行。最后用微量分光光度计测定C3质粒的浓度，-20 ℃冷藏备用。1.3.2 高甲基化的pEGFP-C3质粒转染Bel-7402细胞株
Bel-7402细胞传代培养后，转入24孔培养板培养(铺板密度为每毫升2.0×105个细胞)，每孔加500 μL含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养，待细胞汇合度达80%～90%时，根据X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂盒说明书(Roche)，Fugene HD和甲基化C3质粒以3:1比例配制转染试剂混合物。每孔加入相应转染试剂混合物50 μL，转染6 h。
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1.3.3 以经高甲基化pEGFP-C3质粒转染的Bel-7402细胞株为受试对象进行染毒
细胞转染6 h后进行染毒。根据MTS实验的结果确定各化合物的染毒浓度为3.125、12.5、5
0、200 μmol·L-1，每个浓度设3个平行孔。同时每组实验中均要以5-Aza-CdR为阳性受试物进行细胞梯度剂量共培养染毒处理，用以绘制标准曲线，通过前期实验[10]确定5-Aza-CdR的染毒浓度为 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1，每个浓度同样设3个平行孔。细胞染毒时间均为24 h。
1.3.4 细胞染毒后的荧光差异检测
胰酶消化细胞，离心弃掉上清液后用冷的PBS重悬细胞2次，经300目筛网过滤后移至流式管，用CELL Quest软件进行流式细胞术检测分析。
1.3.5 基于5-Aza-CdR染毒标准曲线的制作
对染毒浓度为0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1的5-AZA-CdR进行流式荧光检测，获得各浓度的荧光阳性细胞比例，再求出各浓度相对于空白对照孔增加的荧光阳性细胞比例，以所得值为纵坐标、相应染毒浓度为横坐标绘制标准曲线。以相同方法获得各重金属化合物相对于空白染毒孔增加的荧光阳性细胞比例，将此值作为y值代入标准曲线方程中求出相应的x，以此x除以其对应的重金属化合物浓度所得值即为各重金属化合物相
应浓度去甲基化能力相对于5-AZA-CdR的当量值。最后计算它们的几何均数，所得结果即是各重金属化合物去甲基化能力相对于5-AZA-CdR的当量值。
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