RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6—methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA, rRNA， tRNA 和snoRNA上都有发生m6A修饰. m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer）”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader）”决定[1
］。“编码器(Writer)"即甲基转移酶,目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429;而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器)可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。 m6A酶系统
METTL3是早先被鉴定为结合SAM的组件，其缺失引起小鼠胚胎干细胞、Hela细胞和HepG2 细胞中m6A peaks的减少.METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的细胞核内亚细胞器－核小斑（Nuclear speckle)上，显示ｍ６Ａ修饰可能和ＲＮＡ的剪切加 工相关.WTAP与手势控制METTL3–METTL14 二聚体相互作用，并共定位于核小斑，影响甲基化效率，参与mRNA剪。而KIAA1429作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整体甲基化进程所必须的［2
].FTO是ALKB家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶,可影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力,进而调控pre-mRNA吊装工具
的剪切加工过程[3
].目前已发现FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关， 揭示m6A可能对这些疾病具有重要的调节功能［4-6
］。ALKBH5是ALKB家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员,以RNase A敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化m6A—甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化［7
]. 此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影响新生mRNA合的成和剪切效率［7
］， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因表达改变的结果［7
］.m6A mRNA修饰执行其功能主要通过两个途径： 精细调控甲基化转录本的结构,以阻止或诱使蛋白-RNA 相互作用;或被直接由 m6A 结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有YTH功能结构域的蛋白被鉴定为m6A修饰的结合蛋白.其中YTHDF1, YTHDF2， YTHDF3, YTHDC1和YTHDC2己被证实是ｍ６Ａ的结合蛋白. YTHDF1主要影响ｍ６Ａ修饰基因的翻译,YTHDF2主要影响ｍ６Ａ修饰基因的降解，而YTHDC1结合ｍ６Ａ修饰的基因后影响其剪接。HNRNPC是一种丰富的核RNA结合蛋白,参与pre—mRNA的加工[8
］，且研究表明HNRNPC通过m6A与 RNA结合调控目标转录本的丰度和选择性剪切[9
]. 图 1 m6A修饰的酶系统[10］
m6A生物学功能
越来越多的证据表明m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能。例如，在转录后水平上调控RNA的稳定性[11]、定位[12]、运输、剪切[13］和翻译[14］。Claudio R. 等发现依赖METTL3的pri-miRNA甲基化，会促进DGCR8识别和加工，从而促进microRNA的成熟[15]。
此外，m6A识别蛋白 HNRNPA2B1促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA [16］.另外，环状RNA上m6A的修饰能促进环状RNA的翻译[17]。m6A修饰在基因表达调控中起着重要的作用,其调控机制的异常可能与人类疾病或癌症相关.目前发现m6A可能会影响精子发育（ALKBH5，METTL3,Ythdc2）、发育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV诱导的DNA损伤反应(METTL3，FTO）、肿瘤生成（YTHDF2）或转移（METTL14)、干细胞更新（METTL14)、脂肪分化(FTO)、生物节律、细胞发育分化、细胞分裂及其它的一些生命过程。例如,ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6）A修饰，其特点是凋亡影响减数分裂中期的精子细胞,引起生育能力受损［7］。METTL3和METTL14增加弱精症精子的m6A水平[18]， 在生殖细胞中,METTL3的敲除严重抑制精子分化和减数分裂的发生，转录组和m6A分析显示 精子发生相关基因的表达和选择性剪接发生了改变［19］。YTHDC2可促进靶基因的翻译效率,并降低其mRNA的丰度,在精子发生过程中起关键作用。当减数分裂开始时YTHDC2表达上调，YTHDC2敲除小鼠的生殖细胞没有经过偶线期的发育导致小鼠不育［20]。在DNA损伤反应中,METTL3可促进DNA聚合酶κ（Pol κ）与核酸剪切修复途径快速定位到UV引起的DNA损伤位点，当缺失METTL3时，细胞无法迅速修复UV照射引起的突变,并且对UV照射更加敏感[25］。在淋巴细胞性小鼠过继
转移模型中， Mettl3缺陷通过影响mRNA m6A修饰,降低SOCS家族mRNA衰减,增加mRNA和蛋白表达水平，从而抑制IL—7介导的 STAT5活性和T细胞内稳态增殖和分化，进而抑制肠炎的发生［21］。在肝癌中，METTL14 通过调控pri-miRNA的m6A修饰,影响MiR-126的生成加工，从而抑制肝癌的转移[22]。在乳腺癌细胞中，低氧刺激能促进依赖低氧诱导因子HIF的ALKBH5的表达,而ALKBH5过表达降低了NANOG mRNA的m6A修饰，从而稳定mRNA提高NANOG的表达水平，最终增加乳腺癌干细胞所占的比例[23］。 此外， 低氧诱导乳腺癌细胞中依赖ZNF217的NANOG 和 KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制,且ALKBH5敲除显著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺转移［24]。在肺癌中,METTL3能够促进肺腺癌细胞的生长、生存和侵袭，但还不清楚它是否作为 m6A 调节器或效应器发挥作用[25］。在急性髓细胞白血病（AML)患者中，m （6) A 调控基因的突变或拷贝数变化与TP53 突变存在密切联系，且m （6） A 调控基因的改变与AML不良预后相关[26]。此外，FTO在AML中高表达，它通过降低mRNA转录本中的m（6）水平，调节ASB2和RARA等靶点的表达，增强了白血病癌基因介导的细胞转化和白血病形成，并抑制全反式维甲酸(ATRA）诱导的AML细胞分化[27］.在脂肪形成过程中，FTO表达与m6A水平成负相关，促进脂肪形成［3]。在胶质细胞瘤样细胞中,ALKBH5 通过lncRNA FOXM1介导FOXM1基因pre—mRNA上的m6A
修饰维持胶质瘤细胞的成瘤性［28］。此外,甲基转移酶METTL3或METTL14的敲除,能够改变m6A的富集和ADAM19的表达，极大地促进了胶质瘤细胞的生长、自我更新和肿瘤形成［29］卧式炭化炉.
图2 m6A RNA修饰和介导的功能[30]翻罐笼
m6A 的研究方向
（1）主要是通过研究 m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究
m6A修饰的生物学功能和作用机制:一般通过敲除m6A酶分子,研究下游功能基因分子的表达和m6A甲基化情况，通过介导相关基因异常（可变剪切、稳定性、翻译、miRNA 调控)影响细胞表型和功能特征。
（2）m6A修饰图谱构建及作用机制：通过m6A甲基化测序(MeRIP—Seq, miCLIP）构建疾病细胞模型或者发病组织的 m6A 修饰谱，分析m6A的motif, peaks数量及分布,Peak 关联基因的特征,联合RNA-seq研究m6A甲基化与表达的关系。
m6A研究思路
m6A研究方案
MeRIP-seq
1.m6A修饰图谱分析
2.m6A修饰差异基因分析
3.差异表达基因m6A修饰特征分析
4.差异表达基因关联分析
MeRIP-PCR、qPCR验证
方案一
TCGA等数据库筛选异常表达的m6A相关基因（疾病vs正常）
临床样本qPCR验证目标基因
肿瘤细胞中干扰目标基因
MTT、流式、transwell等检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移
MeRIP-Seq
RNA-seq
筛选下游基因
IP/pull down验证目标基因通过m6A调控下游基因
方案二
研究案例
研究案例一 （m6A修饰图谱分析）
Berulava T, Rahmann S， Rademacher K, Klein-Hitpass L, Horsthemke B: N6-adenosine methylation in MiRNAs。 PLoS One 2015， 10(2）：e0118438。
在许多不同种类的RNA中，都已观察到N6 -腺苷（m6A）的甲基化，但其在microRNAs中还没有被研究。研究者在FTO1C1， FTO2D4 和 FTO3C3细胞系中，通过敲除m6A甲基转移酶FTO筛选到表达差异的microRNA,说明miRNA受m6A甲基化的调控。进一步通过MeRIP—Seq发现相当一部分的microRNA 具有m6A修饰。通过motif分析，他们发现了区分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。该文章所述的表观遗传修饰在基因表达的转录后调控的复杂性上增加了一个新的层次。
图1 FTO敲除对甲基化的miRNAs的稳定状态的影响。
研究案例二（机制研究）IF=13.2
Ma JZ， Yang F， Zhou CC, Liu F， Yuan JH， Wang F, Wang TT， Xu QG, Zhou WP， Sun SH: 湿电除雾器METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing。 Hepatology 2017， 65（2)：529-543。
m6A修饰已被证明具有重要的生物学功能,但其在癌症上的作用还未得到较好的研究。为探索m6A修饰是否参与肝癌的调控，作者利用试剂盒检测发现m6A整体甲基化在肝癌下调，分离RNA做m6A免疫印迹验证m6A水平在肝癌中下调。
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