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【Naturecommunications】m6A甲基化的巨噬细胞重编程研究，热点必读！

逻辑不乱，⽂献不难！欢迎来到⽂献品谈会！

今天拆解的⽂献于2021年刚发表于Nature communications，影响因⼦是14.919。

⾸先我们来拆解⼀下【题⽬四要素】：RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming管式热交换器原理图

疾病：肿瘤

表型：巨噬细胞重编程，肿瘤⽣长、转移

主变量：Mettl3

机制：下游变量：SPRED2；下游通路：NF-κB/STAT3信号通路

【科学假设】：

【Mettl3】的缺失损害了【YTHDF1】介导的【SPRED2】的翻译，【SPRED2】通过ERK途径增强了【NF-kB和STAT3】的激活，促进【M1/M2样肿瘤相关巨噬细胞的增加和调节性T细胞对肿瘤的浸润】，导致肿瘤【⽣长和转移增加】。

【知识背景】

1.巨噬细胞的分类，除了经典的M1、M2之外，还有肿瘤相关巨噬细胞、CD169＋巨噬细胞、TCR＋巨噬细胞。

巨噬细胞是天然免疫系统特化的，存活时间长，具有吞噬作⽤的细胞。巨噬细胞参与细胞碎⽚和病原体的识别、吞噬和降解。巨噬细胞还在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分⼦等⽅⾯发挥作⽤，从⽽启动适应性免疫反应。

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）

从严格意义上说，TAM并不被认为是巨噬细胞中的⼀个亚，因为这些细胞不是在稳态条件下存在，⽽是在许多肿瘤中被观察到。TAM是与特定病理情况相关的巨噬细胞，其活化状态类似M2巨噬细胞。然⽽，也有实验证据表明TAM不仅是⼀个独特的M2髓样细胞体，⽽且还有同时具备M1和M2信号。

典型活化态的M1巨噬细胞

M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作⽤。M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、粒细胞巨噬细胞集落刺激因⼦（GM-CSF）、肿瘤坏死因⼦α（TNF-α）和1型辅助性T（Th1）细胞因⼦⼲扰素γ（IFN-γ）活化。许多通路能促进巨噬细胞向M1极化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路。

从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因⼦多，如⽩细胞介素1（IL-1）、IL-6、TNF-α、⼀氧化氮（NO）和活性氧（ROS）。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达。M1巨噬细胞的刺激导致IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌⽔平提⾼。此外，M1巨噬细胞表型表达⾼⽔平的主要组织相容性复合体II类（MHCII）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因⼦，包括CXCL9和CXCL12。

替代活化型M2巨噬细胞

M2巨噬细胞可由寄⽣⾍或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因⼦（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因⼦（Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。促进巨噬细胞进⼊M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ。

与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因⼦IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤⼝愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作⽤。

M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。⼀般来说，这种亚型⾼效表达吞噬作⽤和清除⽢露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产⽣。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因⼦有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24。

2. mRNA最常见的内部修饰之⼀包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）

蓄热式加热炉m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因⼦包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋⽩等。甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作⽤是催化mRNA上腺苷酸发⽣m6A修饰。⽽去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作⽤是对已发⽣m6A修饰的碱基进⾏去甲基化修饰。阅读蛋⽩

主要功能是识别发⽣m6A修饰的碱基，从⽽激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加⼯等。

【数据泛读】

本⽂涉及⽣信、细胞、分⼦、动物四个维度，正⽂部分⼀共7张图⽚。稀土镁合金

论证内容主要包括以下部分：

1. Myeloid-specific deletion of Mettl3 promotes tumour growth and metastasis.

Supplementary Figure 1 Myeloid-specific deletion of Mettl3 promotes tumour growth and metastasis.

Fig.S1a-b表达差异：将WTBMDMs（bonemarrow-derivedmacrophages，⾻髓衍⽣的巨噬细胞）与B16细胞或B16细胞培养基共孵育，qRT-PCR与Westernblot分别检测BMDMS中Mettl3和Mettl14的RNA和蛋⽩表达⽔平，发现Mettl3的表达显著降低，⽽Mettl14⽔平没有明显差异。

Fig.S1c表达差异：B16肿瘤WT⼩⿏模型，分别获取从肿瘤组织分离的TAMs（肿瘤相关的巨噬细胞，CD11b F4/80 ）和来⾃同⼀宿主⼩⿏的BMDMs，qRT-PCR和免疫荧光结果均显⽰肿瘤进展期间TAMs中Mettl3的表达⽔平降低。

BMDMs，qRT-PCR和免疫荧光结果均显⽰肿瘤进展期间TAMs中Mettl3的表达⽔平降低。

毛巾挂件Fig.S1d-e构建Mettl3fl/flLyz2 / (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/

(KO)⼩⿏模型，后者是通过Lyz2-Cre⼯具⿏对髓系来源细胞中的Mettl3进⾏敲除，包括了巨噬细胞。分别从WT和KO⼩⿏中获取BMDM和PMs（腹膜巨噬细胞，peritonealmacrophages），结果显⽰KO⼩⿏的BMDMs中Mettl3mRNA表达⽔平降低了75％，PMs中Mettl3降低了80％。

Fig.S1fKOBMDMs中mRNAs的m6A⽔平低于WTBMDMS。

Fig.S1g-j构建⼩⿏模型：LLC细胞⽪下注射到WT或Mettl3-KO⼩⿏中。

KO⼩⿏⽐WT⼩⿏表现出更快的肿瘤⽣长，Mettl3敲除⼩⿏的存活率显著缩短。

Fig.S1k-n构建模型：通过尾静脉将LLC细胞注射到WT或Mettl3-KO⼩⿏中。

铆压机组织学检查表明，与WT⼩⿏相⽐，KO⼩⿏具有较⼤、较多的肺转移结节，KO⼩⿏的整体存活率缩短。

Fig.1 Myeloid-specific deletion of Mettl3 in mice promotes B16 tumourgrowth and lung metastasis.

Fig.1a-d构建模型：B16细胞⽪下注射到WT或Mettl3-KO⼩⿏中。

KO⼩⿏⽐WT⼩⿏表现出更快的肿瘤⽣长，KO⼩⿏的存活率显著缩短。

Fig.1e-f构建模型：通过尾静脉将B16细胞注射到WT或Mettl3-KO⼩⿏中。

体内⽣物成像显⽰与WT⼩⿏相⽐，KO⼩⿏中肺转移增强。

Fig.1g-k肺转移的组织学检查表明，与WT⼩⿏相⽐，KO⼩⿏具有较⼤、较多的肺转移结节，Ki67染⾊增加，导致KO⼩⿏的整体存活率缩短。

Fig.1l与正常组织中的巨噬细胞相⽐，METTL3的表达在TAM中降低。

Supplementary Figure 2 The KO BMDMs enhance tumour growth.

Fig.S2a-dWT或KOBMDMs⽤CFSE标记，并同B16或LLC细胞混合⽪下注射到⼩⿏，接种10天后取出肿瘤组织。

结果表明，CFSE标记的细胞F4/80染⾊是阳性的，表明共注射的BMDMs可以在肿瘤中存活2周（Fig.S2a）。肿瘤组织中的细胞外基质也通过COL1A1染⾊来确定（Fig.S2b）。此外，共注射的CFSE阳性的BMDM⼏乎没有增殖能⼒（Fig.S2c）。B16或LLC细胞与KOBMDMs的共注射，肿瘤显著加速⽣长。

Fig.2Macrophages with Mettl3 depletion enhance tumour growth and lungmetastasis.

Fig.2a-cWT或KOBMDMs⽤CFSE标记，并同B16细胞混合⽪下注射到⼩⿏，接种10天后取出肿瘤组织。KOBMDMs组的⼩⿏，肿瘤加速⽣长、体积和体重显著增⼤。

Fig.2d-fWT或KOBMDMs⽤CFSE标记，并同LLC细胞混合⽪下注射到⼩⿏，接种10天后取出肿瘤组织。KOBMDMs组的⼩⿏，肿瘤加速⽣长、体积和体重显著增⼤。

Fig.2g-h在实验前2天⽤Clodronate脂质体注射WT和KO⼩⿏，⽬的是清除⼩⿏体内的巨噬细胞。然后，将B16细胞静脉内注射到⼩⿏中。⽣物发光成像显⽰，巨噬细胞耗尽后，WT和KO⼩⿏之间肿瘤⽣长和转移⽆差异。

Fig.2i-j巨噬细胞耗尽后，WT和KO⼩⿏之间肺组织转移情况⽆差异。

Fig.2k巨噬细胞耗尽后，⼩⿏的存活率延长，同时WT和KO⼩⿏之间的⽣存率⽆差异。

1. Mettl3 depletion in macrophages reshapes the tumour microenvironment by enhancing M1- and M2-like TAM and Treg infiltration into tumours. Supplementary Figure 4 Mettl3 depletion in macrophages changes the immune

microenvironment in spleen and lung.

Fig.S4a-c通过流式细胞术进⾏脾脏和肺的免疫表型分析，

并确定KO⼩⿏中M1巨噬细胞（CD11b F4/80 NOS2high或CD11b F4/80 IL-12high），

M2巨噬细胞为（CD11b F4/80 ARG1high或CD11b F4/80 IL-10high）和调节T细胞（CD4 CD25 Foxp3 ）的百分⽐显著增加。

Fig.S4d-eKO⼩⿏中MDSCs(CD11b Gr1 )，CD3 CD4 和CD3 CD8 Tcells的百分⽐⽆差异。

SupplementaryFigure 5 Immune infiltration profiling in B16 tumours with scRNA-Seq.

爬墙式富集B16肿瘤中的CD45 免疫浸润细胞，通过scRNA-seq分析WT和KO组分别五只⼩⿏，根据表达标志确定不同的免疫细胞。

Fig.S5a揭⽰了23个不同的肿瘤免疫细胞，巨噬细胞（7个细胞簇），MDSC（2个细胞簇），粒细胞（2个细胞簇），CD4 T细胞（1个细胞簇），CD8 T细胞（2个细胞簇），NK细胞（1个细胞簇），B细胞（2个细胞簇），树突细胞（DCs，2个细胞簇），⾎浆树突细胞（pDCs，1个细胞簇），常规树突细胞（cDC，1个细胞簇），成纤维细胞（1个细胞簇）和肿瘤细胞（1个细胞聚类）。

Fig.S5b与WT⼩⿏的肿瘤相⽐，来⾃KO⼩⿏的肿瘤显⽰出免疫浸润的组成的差异，其包括增加的TAMs，MDSCs和CD4 T细胞的数量，以及粒细胞和

CD8 T细胞数量减少的趋势。

Fig.3 Mettl3 depletion in macrophages establishes an immunosuppressive microenvironment by enhancing M1- and M2-like TAM and Treg infiltration

in tumours.

Fig.3a通过流式细胞术分析Mettl3-KO⼩⿏的B16肿瘤组织中巨噬细胞的免疫表型，显⽰出M1-和M2样TAMs的总百分⽐增加。

Fig.3b-dMettl3-KO⼩⿏的B16肿瘤组织中MDSCs和调节性T细胞的百分⽐增加。

Fig.3e-f通过qRT-PCR和ELISA，来⾃B16或LLC肿瘤的Mettl3-KOTAM中，CCL22表达显著上调。

Fig.3g-k将B16细胞静脉内注射到WT和KO⼩⿏中。分别在Days-2,1,4,7和11注射抗CD25抗体。接受抗CD25抗体处理的WT和KO⼩⿏没有显⽰出肿瘤⽣长或转移的显著差异，⽽在未处理的组KO⼩⿏中观察到增加的肿瘤⽣长。

Fig.3lTreg细胞耗尽后，⼩⿏的存活率延长，同时WT和KO⼩⿏之间的⽣存率⽆差异。

Supplementary Figure 6 Mettl3 depletion in macrophages reshapes the tumour microenvironment by enhancing M1 and M2-like TAMs and Treg infiltration.

Fig.S6a通过流式细胞术分析Mettl3-KO⼩⿏的LLC肿瘤组织中巨噬细胞的免疫表型，显⽰出M1-和M2样TAMs的总百分⽐增加。

Fig.S6bMettl3-KO⼩⿏的LLC肿瘤组织中MDSCs和调节性T细胞的百分⽐增加。

Fig.S6c-dCD3 CD4 和CD3 CD8 T细胞的百分⽐不受影响。

本文发布于:2024-09-24 07:22:10，感谢您对本站的认可！

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标签：细胞肿瘤表达

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