《中国癌症杂志》2013年第23卷第10期
CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No.10777宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子 及第1外显子区甲基化状态的研究
汪姗姗1 王宁1 于啸1,2 杨晨曦1 闫丽萍1 王言奎1
1.青岛大学医学院附属医院妇产科，山东 青岛266003；
2.青岛市妇女儿童医疗保健中心妇产科，山东 青岛266011
［摘要］ 背景与目的：抑癌基因Ras相关区域家族1A (Ras association domain family 1A，RASSF1A)启动子及第1外显子区CG位点高甲基化导致该基因沉默与多种恶性肿瘤的发生发展相关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态以及甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-dc)作用对RASSFIA基因表达的影响。方法：采用5 µmol/L(低浓度)和 10 µmol/L(高浓度)的5-Aza-dc作用于HeLa、Caski、HT-3以及C-33A等4种宫颈癌细胞系，分别采用甲基化特
异PCR (methylation-specific PCR，MSP)和亚硫酸盐基因组测序法(bisulfite genome sequencing，BGS)检测5-Aza-dc处理前后RASSF1A基因启动子及第1外显子区甲基化状态，RT-PCR检测干预前后RASSF1A基因mRNA的转录表达。结果：HeLa和Caski两种HPV阳性细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区均呈低甲基化状态，mRNA
表达阳性。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后，mRNA表达未见明显改变(F
HeLa =3.003，P=0.125；F
Caski
=0.045，
P=0.956)。HT-3和C-33A两种HPV阴性宫颈癌细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区则表现为高度甲基化状态，mRNA表达受到抑制。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后，HT-3和C-33A细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区CG位点甲基化程度降低，检测到其mRNA表达，高浓度5-Aza-dc作用组表达水平明显高于低浓度组和细胞对
照组(F
HT-3=18.002，P=0.03；F
C-33A
=17.179，P=0.03)，LSD-t检验显示差异有统计学意义(P<0.05)。结论：HPV
阳性和HPV阴性宫颈癌细胞系中RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态不同；RASSF1A基因启动子及第1外显子区的高甲基化可抑制该基因表达；5-Aza-dc处理可使RASSF1A基因启动子及第1外显子区去甲基化，重新激活基因的表达，这种作用在一定范围内有剂量依赖性。
［关键词］ Ras相关区域家族1A基因；人宫颈癌细胞系；5-氮杂-2’-脱氧胞苷；DNA甲基化；TA克隆 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.001
中图分类号：R737.33 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2013)10-0777-07
Study on methylation status of RASSFIA gene promoter and exon 1 in cervical cancer cell lines WANG Shan-shan1, WANG Ning1, YU Xiao1,2, YANG Chen-xi1, YAN Li-ping1, WANG Yan-kui1 (1.
Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao Shandong 266003, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, Qingdao Women and Children Medical Healthcare Center, Qingdao Shandong 266011, China)
Correspondenceto:WANGYan-kuiE-mail:********************
［Abstract］ Background and purpose:Loss or altered expression of Ras association domain family 1A gene (RASSF1A) through DNA methylation has been associated with the pathogenesis of a variety of cancers, which suggests the tumor suppressor function of this gene. This study aimed to explore the effect of DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2’deoxycytidine (5-Aza-dc) on demethylation and expression of RASSF1A in cervical cancer cell lines. Methods: HPV positive cervical cancer cell lines HeLa and Caski, HPV negative cell lines HT-3 and C-33A were treated with two different concentration of 5-Aza-dc (5 µmol/L, 10 µmol/L). MSP (methylation-specific PCR) and Bisulfite genomic sequencing PCR (BGS) combined with TA clone were used to investigate methylation status of RASSF1A gene promoter and exon 1 before and after treatment of 5-Aza-dc. RASSF1A gene mRNA expression 基金项目：国家自然科学基金(No：81172480)。
通信作者：王言奎 E-mail:********************
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研究证实，人类肿瘤组织中存在着多种肿瘤抑制基因的高甲基化［1］。某些肿瘤抑制基因启动子区的高甲基化可沉默该基因的表达，导致该基因失活，进而参与肿瘤的发生。Ras 相关区域家族1A (Ras association domain family 1A ，RASSF1A)是2000年由Dammann 等［2］利用酵母双杂交筛选
从3号染体短臂(3p21.3)克隆获取的新型肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene ，TSG)，其表达产物具有调节细胞凋亡和细胞周期检查点的功能。有研究表明，RASSF1A 表达缺失是人类肿瘤发生中的一个早期普遍事 件［3］。胰腺癌、胃癌等多种人类肿瘤组织中可检测到RASSF1A 启动子的异常高甲基化［4-5］。Kuzmin 等［6］在10%的宫颈鳞状细胞癌、21%的宫颈腺鳞癌以及24%的宫颈腺癌组织中也发现RASSFIA 基因启动子的高甲基化。
本研究选择4种宫颈癌细胞系作为研究对象，检测其RASSFIA 基因启动子及第1外显子区CpG 位点的甲基化状态，探讨HPV 感染与RASSFIA 基因启动子及第1外显子区甲基化状态的关系。分析甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine ，5-Aza-dc)对RASSFIA 基因启动子区甲基化逆转以及诱导RASSFIA 基因重新表达的作用，明确高甲基化是否影响该基因的表达，为进一步筛选HPV 相关宫颈癌表观遗传学分子标志提供实验依据。
吊耳
was detected by RT-PCR. Results: Two HPV positive cell lines showed hypomethylated RASSF1A promoters and expressed RASSF1A mRNA, and after treatment with 5-Aza-dc, the mRNA expression of RASSF1A did not change significantly (F HeLa =3.003, P =0.125; F Caski =0.045, P =0.956). Two HPV negative cervical cancer cell lines showed hypermethylation status of RASSF1A promoter and silenced RASSF1A. After treatment with 5-Aza-dc, demethylation occurred in the promoter region of RASSF1A gene, which subsequently induced re-expression of this gene in HT-3
and C-33A. The F test (F HT-3=18.002, P =0.03; F C-33A =17.179, P =0.03) and LSD-t test (P <0.05) demonstrated that significant difference in the expression of RASSF1A was found upon two different concentrations drug treatment.Conclusion: The methylation status of promoter and exon 1 of RASSFIA gene in HPV positive and HPV negative cervical cancer cell lines are different. The promoter hypermethylation is correlated with RASSF1A gene expression in HPV negative cervical cancer cell line HT-3 and C-33A, and plays a key role in RASSF1A silencing. 5-Aza-dc may effectively reverse the methylation status of RASSFIA gene promoter in cervical cancer HT-3 and C-33A cells and reactivate gene expression silenced by aberrant hypermethylation in a dose-dependent manner within certain extent.
［Key words ］ Ras association domain family 1A (RASSF1A); Human cervical cancer cell line; 5-Aza-2-deoxycytidine; DNA methylation; TA clone
1 材料和方法
1.1 细胞系
HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa 及HPV 阴性宫颈癌细胞系HT-3为青岛大学医学院微生物实验室保存，HPV16阳性宫颈癌细胞系Caski 购自中国医学科学院肿瘤研究所，HPV 阴性宫颈癌细胞系C-33A
购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。均用含10%胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的高糖DMEM 培养基(购自美国GIBCO 公司)，37 ℃、饱和湿度、CO 2体积分数为5%的培养箱中传代培养。
1.2 5-Aza-dc处理
取3×105个/mL 指数生长期上述4种宫颈癌细胞，于25 cm 2细胞培养瓶过夜培养后，加5-Aza-dc(购自Sigma 公司)处理，实验包括5 µmol/L(低浓度)和10 µmol/L(高浓度)。每24 h 更换培养基，维持5-Aza-dc 浓度；以不加5-Aza-dc 处理组作为对照，培养5 d 后收集各组细胞。1.3 细胞DNA的亚硫酸盐修饰
胰蛋白酶消化收集上述各组细胞，PBS 轻洗细胞3次后，离心收集细胞沉淀，酚-氯仿-异戊醇法常规提取细胞DNA ，分别取各组细胞DNA 5 µg ，参照文献［7］进行焦亚硫酸盐修饰。采用DNA 纯化试剂盒(Qiagen ，Hilden ，
汪姗姗，等.宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态的研究
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Germany)对修饰后的DNA 进行脱盐纯化处理，用50 µL TE 缓冲液洗脱经过脱盐纯化的DNA ，室温下静置5 min ，加3 mol/L 的NaOH 5.56 µL ，37 ℃水浴15 min ，再加新鲜配制的9 mol/L NH 4OAc (pH=7.0)，3 mol/L NaOAc (pH=5.2) 使其脱磺化基团。50 µL TE 洗脱最终纯化的DNA ，置于−20 ℃冰箱保存备用。 1.4 甲基化特异PCR (methylation-specific PCR, MSP)
参照文献［8］设计合成检测RASSF1A 基因启动子及第1外显子区甲基化状态的特异性引物(表1)。取亚硫酸盐修饰处理后的各组细胞DNA 为模板，阴性对照为无菌纯水。取5 µL 扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察并记录结果，每次实验进行3次重复验证。1.5 亚硫酸盐基因组测序法(bisulfite genome sequencing, BGS)
引物采用Methy primer express v1.0软件设计，序列及反应条件见表1。反应体系包括：TaqHS (5 U/µL) 0.25 µL 、10×PCR Buffer (含Mg 2+) 5 µL 、dNTPs (各2.5 mmol) 4 µL 、上游及下游引物各(10 µmol) 1 µL 、0.05 µg 修饰后细胞DNA 作为模板、去离子水加至50 µL 。PCR 产物
于2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增结果。1.6 TA克隆测序
凝胶成像系统长波紫外灯下自琼脂糖凝胶切取目的PCR 产物，采用德国QIAGEN 公司DNA 纯化试剂盒回收纯化。将纯化产物进行TA 克隆连接，PMD18-T 载体试剂盒购自TakaRa 公司，操作按试剂盒说明进行。连接产物转化感受态大肠杆菌后氨苄LB 平板培养，至长出蓝白单克隆菌落。取微量白菌
落作为模板进行菌落PCR 验证， 将阳性单克隆菌落接种至含有氨苄抗性LB 液体培养基培养，取5 mL 菌液送北京华大基因测序。应用MegAlign (DNASTAR, Inc, Madison, WI)和ChromasLite 软件(Technelysium Pty Ltd, Eden Prairie, MN)与基因组序列(NM 号：170714)进行比对分析。
1.7 RT-PCR检测RASSFIA基因mRNA表达 TRIzol 一步法提取各组细胞总RNA ，采用Thermo 公司的逆转录试剂盒合成cDNA ，RT-PCR 检测5-Aza-dc 作用组及对照组RASSFIA 基因mRNA 转录表达的差异。同时以管家基因葡萄糖磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)作为内参照。扩增用引物参照文献［8］合成(表2)。
1.8 统计学处理
采用SPSS 18.0统计软件包对实验数据进行统计学分析，比较5-Aza-dc 作用前后4种宫颈癌
表 1 MSP和BGS所用引物序列及反应条件
Tab. 1 The primer sequences and reaction conditions of MSP and BGS
Primers Sequence (5’→3’)
Genomic position
Product size/bp
Annealing temp/℃
MSP-MF GAGAGCGCGTTTAGTTTCGTTTTC -64 to -41184
56
MSP-MR ACCCGTACTTCGCTAACTTTAAAG +96 to +120MSP-UF GAGAGTGTGTTTAGTTTTGTTTTTG -64 to -4018356MSP-UR CCCATACTTCACTAACTTTAAACC +95 to +119BGS-F GGTTAAGTGTGTTGTTTTAGTAAT -271 to -246704
60
喷胶BGS-R
CTACCCCTTAACTACCCCTTCC
+413 to +434
M: Methylated; U: Unmethylated; F: Forward primer; R: Reverse primer. MF/MR was designed for th
e amplification of the bisulfite-converted methylated promoter; UF/UR was designed for amplification of the bisulfite-converted unmethylated promoter; BGS-F/BGS-R was primers for the amplification of RASSFIA promoter and exon 1.
表2 RT-PCR引物序列及反应条件
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Tab. 2 The primer sequences and reaction conditions of RT-PCR
Primers Sequence (5’→3’)
Product size/bp
Annealing temp/℃
Cycle RT-F TCTGTGGCGACTTCATCTGG 424
60
35RT-R
TTGGGCAGGTAAAAGGAAGT GAPDH-F CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA 499
60
35
GAPDH-R
ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA
F: Forward primer; R: Reverse primer.
细胞系中RASSFIA 基因mRNA 表达差异采用单因素方差分析，方差齐者组内比较采用LSD-t 检验，P <0.05为差异有统计学意义。
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2.2 RASSFIA基因启动子及第1外显子CpG位
京洲灯饰
点测序结果
将B G S 产物进行TA 克隆后，分别选取HeLa 、Caski 、HT-3及C-33A 等4种宫颈癌细胞系各10个阳性克隆进行测序，检测RASSFIA 基因启动子及第1外显子区64个CpG 位点的甲基化状态。结果显示2种HPV 阳性细胞系HeLa 及Caski 中，除个别位点发生甲基化外，其余位点均未发生甲基化；而2种HPV 阴性宫颈癌细胞系HT-3及C-33A 则表现为几乎所有位点的甲基化(图2A)。两种不同浓度5-Aza-dc 作用于HT-3和C-33A 细胞系后，甲基化程度降低(图2B)。截取HPV 阴性HT-3细胞系5-Aza-dc 作用前后部分序列测序信号结果，未见套峰及杂峰现象(图3)，测序结果准确可靠。
图 1 MSP和BGS检测4种宫颈癌细胞系5-Aza-dc作用前后
RASSFIA基因甲基化电泳结果
Fig. 1 The results of RASSFIA gene promoter and exon 1 methylation detected by MSP and BGS in cervical cancer cell
lines
A: MSP results; M: Methylated; U: Unmethylated; Ma: Maker DL2000; 1: Control group; 2: 5 µmol/L5-Aza-dc; 3: 10 µmol/L 5-Aza-dc; 4: Double distilled water; B: BGS results; 1-4: HeLa, CaSki, HT-3, C-33A control groups; 5: HT-3 with 5 µmol/L 5-Aza-dc; 6: HT-3 with 10 µmol/L 5-Aza-dc; 7: C-33A with 5 µmol/L 5-Aza-dc;
8: C-33A with 10 µmol/L 5-Aza-dc; 9: Double distilled water.
2 结 果
2.1 RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化检测结果
MSP 结果显示，2种HPV 阳性宫颈癌细胞系HeLa 和Caski 中，细胞对照组、低浓度及高浓度5-Aza-dc 处理组只出现U 条带；而在2种HPV 阴性宫颈癌细胞系HT-3和C-33A ，细胞对照组只出现M 条带，低浓度和高浓度5-Aza-dc 作用后，2种细胞系均为M+U 条带(图1A)。BGS 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后可观察到704 bp 的特异性目的片段(图1B)
。
图 2 4种宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区TA
克隆测序结果
Fig. 2 CpG methylation status of RASSFIA gene promoter and
exon 1 detected by TA clone and BGS
Each circle is one CpG site and filled circles are methylated CpG sites. There are 64 CpG sites in RASSFIA gene promoter and exon 1 from -300 bp to 404 bp. A: Four cervical cancer cells without 5-Aza-dc. B: HT-3 and C-33A cell lines treated with 5-Aza-dc. -1: 5 µmol/L 5-Aza-dc; -2: 10 µmol/L5-Aza-dc.
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图 3 HPV阴性细胞系HT-3 RASSFIA基因启动子部分位点甲基化状态测序结果 Fig. 3 Sequencing results of RASSFIA gene promoter and exon 1 in HT-3 cell line.
A: In HT-3 control group, four CpG sites showed CG; B: After treatment with 5-Aza-dc, CG turn to TG. Four CpG sites in the sequence corre-spond to 6, 7, 8, 9 CpG sites in figure 2.
2.3 5-Aza-dc作用对RASSFIA基因mRNA转录表达的影响
RT-PCR 检测结果显示，2种HPV 阳性宫颈癌细胞5-Aza-dc 处理前后均可检测到RASSFIA 基因的表达(图4)，经单因素方差分析，差异无统计学意义(F H e L a =3.003，P =0.125；F Caski =0.045，P =
0.956)。而2种HPV 阴性宫颈癌细胞系HT-3和C-33A 在5-Aza-dc 处理前RASSFIA 基因表达缺失，2种不同浓度的5-Aza-dc 处理后可以检测到RASSFIA 基因重新表达，RASSFIA 基因的转录表达随5-Aza-dc 浓度升高而增强 (F H T-3=18.002，P =0.03；F C -33A =17.179，P=0.03)，经LSD-t 检验呈剂量依赖性，差异有
图 4 4种宫颈癌细胞系5-Aza-dc处理前后RASSFIA基因
mRNA表达
铁水预处理Fig. 4 RASSFIA mRNA expression detected by RT-PCR in four
cervical cancer cell lines
M: Maker DL2000; 1, 4, 7, 10: Control groups; 2, 5, 8, 11: 5 µmol/L 5-Aza-dc; 3, 6, 9, 12: 10 µmol/L 5-Aza-dc; 13: Double distilled water.
统计学意义(P <0.05，表3)。
Cell Group F P Control 5 µmol/L 10 µmol/L HeLa 0.42±0.050.43±0.050.42±0.06 3.003 0.125Caski 0.39±0.05
0.39±0.050.40±0.04 0.045 0.956HT-30 0.15±0.07* 0.33±0.09＃△18.0020.03C-33A
0.12±0.05*
0.30±0.06＃△
17.179
0.03
*, #: Compared with control group, P ＜0.05; △: Compared with 5 μmol/L group, P ＜0.05.
表 3 不同浓度5-Aza-dc处理4种宫颈癌细胞系前后mRNA表达差异
Tab. 3 The comparison of mRNA expression in four cervical cancer cell lines treated with 5-Aza-dc
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