茶叶科学 2021，41（1）：28~39
Journal of Tea a-science 茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析 陈瑶，张伟富，任恒泽，熊飞，张豪杰，姚利娜，刘莹，王璐，王新超，杨亚军*，郝心愿*中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心/农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江杭州 310008
摘要：DNA去甲基化酶（dMTase）是主动去甲基化过程中具有糖基化酶和脱嘌呤裂合酶活性的双功能酶。基于茶树基因组数据，本研究利用生物信息学方法对茶树DNA去甲基化酶（CsdMTase）编码基因进行了全面鉴定和序列分析。全基因组鉴定结果表明，舒茶早基因组中包含4个CsdMTases，系统进化分析将CsdMTases 分为DME和ROS两个分支，基因结构分析显示不同成员之间的基因序列长度和内含子数量存在差异。不同CsdMTases蛋白的理化性质相似，均包含ENDO3c和RRM_DME典型的保守结构域，且都定位在细胞核中。CsdMTases家族基因启动子区域包含大量光信号响应、植物激素响应、胁迫响应和生长发育等相关顺式作用元件。表达分析结果显示，CsdMTas e基因在不同组织器官中均有表达，有一定的组织特异性；在菌（Colletotrichum camelliae）、拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）和茶尺蠖（Ectropis oblique）等生物胁迫及干旱等非生物胁迫下，CsdMTase的表达均被显著诱导；冬季休眠过程中CsdMTases在不同品种成熟叶和越冬芽中的表达模式存在显著差异；CsDMEa、CsDMEb在花芽发育及种子萌发的不同阶段的表达存在显著上调过 程。CsdMTases介导的主动去甲基化过程在调控茶树胁迫应答和生长发育中可能发挥了重要的作用，为深入揭示茶树表观调控机制提供理论依据。
关键词：茶树；DNA去甲基化酶；逆境胁迫响应；生长发育；表达分析
中图分类号：S571.1；Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2021)01-028-12
Genome-wide Investigation and Expression Analysis of DNA Demethylase Genes in Tea Plant (Camellia Sinensis)
CHEN Yao, ZHANG Weifu, REN Hengze, XIONG Fei, ZHANG Haojie, YAO Lina, LIU ying, WANG Lu, WANG Xinchao, YANG Yajun*, HAO Xinyuan* Tea Research Institute of the Chinese Agriculture Science/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China
Abstract: DNA demethylase (dMTase) is a bifunctional enzyme with activities of glycosylase and apyrimidic lysase during active demethylation. Based on the available genome data of tea plant, bioinformatics analysis was used to comprehensively identify DNA demethylases (CsdMTase) in tea plant. The genome-wide identification results show that the tea cultivar Shuchazao contains 4 CsdM
Tases. These CsdMTases could be divided into two branches (DME and ROS) with differences in gene length and intron number by phylogenetic and gene structure analysis. Further analysis shows that the physical and chemical properties of different CsdMTase proteins are similar, which contain the typical conserved domains of ENCO3c and RRM_DME and are located in the nucleus. The promoter regions of CsdMTases contain a large number of cis-acting components related to light response, plant hormone response, stress response and growth and development. The CsdMTase genes are expressed in all detected tissues with certain tissue
软件自动化测试技术收稿日期：2020-05-27 修订日期：2020-06-17
基金项目：国家自然科学基金（31972461）
作者简介：陈瑶，女，硕士研究生，主要从事茶树遗传育种研究。*通信作者：******************，*****************
1期陈瑶，等：茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析29
specificity. The expressions of CsdMTases were significantly up-regulated under biotic stresses, including Colletotrichum camelliae, Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis and Ectropis oblique tre
atments. During winter dormancy, different expression patterns of CsdMTases were detected in mature leaves and overwintering buds of different cultivars. The expressions of CsDMEa and CsDMEb at different stages of flower bud development and seed germination were significantly induced. The results show that active DNA demethylation process mediated by CsdMTases plays a crucial role in regulating the stress responses, growth and development of tea plant, providing a theoretical basis for discovering the epigenetic regulation mechanism in tea plant.
Keywords:tea plant, DNA demethylase, stress response, growth and development, expression analysis
DNA甲基化是表观遗传调控的重要机制之一，在调控基因表达、基因印记、转座子沉默以及维持基因组稳定性中发挥重要作用。在植物中，DNA甲基化主要通过DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基基团转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-meC）[1]。依据甲基化的过程，可以大致分为2种类型：（1）从头合成甲基化，即两条链均未被甲基化的DNA被甲基化；（2）维持甲基化，以甲基化的DNA单链为模板，通过DNA复制对新生链进行甲基化修饰。依据甲基化的碱基位点，可以将其分为3种类型：CG、CHG、CHH（H指A、C或T）。在植物中，CG位点的甲基化由甲基转移酶（Methyltransferase 1，MET1）维持[1]；对称的CHG的甲基化主要由染质甲基化酶（Chromomethylase 3，CMT3）与组蛋白抑制标记
结合对未甲基化的CHG进行修饰[1]；而非对称的CHH的甲基化的建立主要通过RNA 介导的从头合成途径（RNA-directed DNA methylation，RdDM）完成[2]。典型的RdDM 包含3个主要的步骤：RNA聚合酶Ⅳ的转录，从头合成的DNA甲基化和异染质的形成[3]。植物中3种类型的甲基化均会引起植物整体DNA甲基化水平的升高。基因组中DNA甲基化的水平不仅取决于DNA甲基化的建立与维持，也取决于DNA去甲基化的发生。DNA去甲基化是DNA甲基化的相反过程，即5-甲基胞嘧啶被未修饰的胞嘧啶替代的过程。在植物中，DNA去甲基化可以分为2类，一类是被动的去甲基化，是由于DNA复制过程中甲基转移酶活性的丧失或甲基供体的缺乏导致甲基化无法维持，从而使整个基因组DNA甲基化水平降低[4]；另一类是主动的去甲基化，即不依赖DNA复制，由一系列酶催化的酶促反应过程。与DNA甲基化不同的是，去甲基化的完成需要包含DNA糖基化酶/裂合酶（DNA glycosylase/lysase）在内的一系列酶的催化，而不是单一的DNA甲基转移酶。在植物DNA 主动去甲基化过程中，DNA糖基化酶/裂合酶可以识别并直接去除5-meC。DNA糖基化酶通过特异性裂解N-糖基键切除5-meC[5]，从而启动碱基切除修复机制。随后，裂合酶对DNA 进行切割，产生缺乏核苷酸的位点，并在切口处产生3′-羟基，DNA聚合酶向其添加未甲基化的胞嘧啶，DNA连接酶通过密封切口来完成修复过程。因此，基因组DNA甲基化的总体水平受DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶（DNA demethylase，dMTase）的共同作用。
dMTase是主动去甲基化过程中具有糖基化酶和脱嘌呤裂合酶活性的双功能酶，含有1个具有DNA结合
活性的典型的双螺旋发卡结构，主要负责识别并移除5-mC碱基、裂解DNA骨架，以便未甲基化胞嘧啶的添加。植物5-meC DNA糖基化酶归属DEMETER-LIKE（DML）家族，是分子量最大、功能最丰富的DNA糖基化酶。在拟南芥中已鉴定的去甲基化酶有ROS1（Repressor of silence 1），DME（Transcriptional activator
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demeter），DML2（Demeter-like protein 2）和DML3（Demeter-like protein 3），4个dMTase 均归属DNA糖基化酶家族，除包含1个典型的由HhH-GPD（Helix–hairpin–helix and a Gly/Pro rich loop）组成的具有催化活性的糖基化酶结构域外，还在氮端含有1个短的富含亮氨酸的结构域以及碳端含有1个对催化活性必不可少的大结构域[6]。研究表明，DME可以激活被甲基化沉默的印迹基因MEDEA的母体表达，对拟南芥胚乳建立基因组印迹至关重要[7]。ROS1可以通过去甲基化目标DNA启动子来抑制同源依赖的转录基因沉默，是释放高甲基化转基因的转录沉默所必需的糖基化酶[8]。DML2和DML3可以通过去除基因5′和3′甲基化，从而保护内源基因免受潜在的甲基化危害[5]。在其他植物中，已鉴定番茄（Solanum lycopersicum）中含有dMTase基因3个[9]，水稻（Oryza sativa）中6个[10]，杨树（Populus trichocarpa）中5个[11]。尽管在上述植物中dMTase基因已得到广泛分析和鉴定，但是dMTase的保守性及多态性显示不同植物、不同物种中的dMTase数量和功能都存在很大差异，而相对于模式草本植物而言，对多年生木本植物中dMTase家族基因的研究还有待深入。
茶树是多年生木本经济作物，分布地域广，生长周期中会遇到低温、干旱、病虫害等生物和非生物逆境。茶树在冷驯化阶段，其基因组伴随着DNA甲基化水平的变化，表明DNA甲基化参与茶树的冷驯化过程，与茶树的抗寒性息息相关[12]。DNA甲基化酶和dMTase基因在干旱胁迫过程中相对表达量呈现显著变化[13]。当前有关茶树DNA去甲基化酶（CsdMTase）的研究还不够深入，在茶树的生长发育以及生物胁迫调控中的作用尚不清楚。因此，本研究以公布的小叶种茶树舒茶早基因组为参考，对茶树CsdMTase家族基因进行了全面的鉴定。结合表达分析，以期揭示CsdMTase在茶树生长发育（开花、种子萌发、芽休眠形成及解除）和逆境胁迫，如菌（Colletotrichum camelliae）、拟盘多毛孢菌(Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis)、茶尺蠖（Ectropis oblique）和干旱中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
以种植于中国农业科学院茶叶研究所试验茶园的20年生茶树舒茶早、龙井43和碧云为试验材料，分别采取茶树的幼嫩叶片和顶芽用于CsdMTase的鉴定。
以种植于中国农业科学院茶叶研究所试验茶园的20年生茶树早生品种龙井43，中生品种碧云，晚生品种政和大白为试验材料，从2018年9月下旬茶树进入休眠期开始至翌年休眠解除止，依据芽的发育和天气情况于茶树休眠形成阶段、深休眠阶段和萌发阶段采摘剪口下第一腋芽和成熟叶，用于茶树Csd
MTase 芽和叶休眠形成及解除阶段的表达分析。
以龙井43为试验材料，采取自然生长条件下茶树的根、茎、叶、顶芽、腋芽、花蕾和盛花用于组织特异性表达分析；参照熊飞等[14]所述的生物胁迫取样方法，以未接种茶树为对照，给茶树分别接种菌、拟盘多毛孢菌、茶尺蠖处理，于12 h和24 h采取接种后的叶片用于茶树CsdMTase生物胁迫下的表达分析；于2019年11月上旬采取茶树CsdMTase 不同阶段的花用于花芽发育阶段基因表达分析，同时采回种子用于茶树CsdMTase种子萌发过程的表达分析，处理方法为将种子均分为两份，一份作为萌发前基因表达量测定，另一份扒掉种皮后埋于珍珠岩中萌发，待胚根长至1~2 cm时拔出洗净用于萌发后基因表达量测定。干旱胁迫取样以盆栽龙井43为材料，人工气候室正常培养（25℃，12 h光照/12 h黑暗，湿度65%），对照组正常浇水，处理组不浇水，处理18 d；每隔3 d取样1次，每次采取每盆的第2~3片叶子，用于基因表达分析。每次采样完毕对照组浇水。以上取样及处理均设3个生物学重复，取样后立即放入液氮，置
1期陈瑶，等：茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析31
镀锌光亮剂于–80℃冰箱中保存备用。
1.2 家族基因鉴定
从拟南芥信息资源数据库（www.arabidopsis）下载拟南芥中已知的dMTase基因序列，并利用这些序列从茶树参考基因组[15-17]中通过Blast同源比对得到茶树舒茶早中的CsdMTase基因。为了进一步验证这些序列在茶树中的准确性，利用Pfam数据库31.0中的隐式马尔可夫模型（HMM）搜索，进一步验证了dMTase中两个特征结构域的存在。然后，检索已鉴定成员的基因组，转录本，编码序列和蛋白序列，利用ProtParam 分析程序预测蛋白分子量、等电点、氨基酸组分等。之后，设计荧光定量引物用于CsdMTase 基因短片段的克隆验证，PCR产物送至杭州有康生物科技有限公司进行测序，测序结果与原序列进行比对。
1.3 基因序列、结构比较分析
为了进一步了解茶树CsdMTase基因结构特征，从Phytozome （www.phytozome），NCBI（bi.v）和JGI （www.v）网站下载5种植物（水稻、玉米、葡萄、杨树、拟南芥）的dMTase蛋白序列。利用clustalw进行多序列比对，采用邻接法利用MEGA 7.0进行系统进化树构建。利用SMART对CsdMTase进行保守结构域分析。使用Tbtools软件对基因的进化树和保守结构域进行分析。利用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS）进行基因内含子-外显子结构分析。为了分析CsdMTase启动子的顺式作用元件，从茶树基因组数据集中检索起始密码子的上游序列（2 000 bp），利用Plant CARE （bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/p lantcare/html）工具分析启动子顺式作用元件。分析结果使用Tbtools软件进行可视化。
1.4 核酸提取及表达分析
1.4.1 总RNA的提取及cDNA的合成
以龙井43、碧云、政和大白不同休眠阶段的越冬芽、成熟叶，龙井43、碧云和舒茶早幼嫩叶片，龙井43不同开花阶段的花、不同萌发状态的种子、干旱胁迫处理的叶片、生物胁迫处理的叶片为材料，按照CTAB法提取不同处理样品的总RNA，用NanoDrop ND2000 微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，1%变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，参照PrimeScript®RT reagent Kit反转录试剂盒[Takara，宝生物工程（大连）有限公司]说明书反转录合成cDNA用于基因表达分析。
1.4.2 基因表达分析
利用Primer-Blast设计目的基因特异性定量引物（表1）。以茶树CsPTB为内参基因[16]，荧光定量反应体系SYBR Mix （Roche, Basel, Switzerland）5.0 μL、cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，加水至终体积10 μL。充分混匀，短暂离心后，于LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为95℃ 5 min；95℃ 10 s，56℃ 15 s，12℃12 s，45个循环后增加溶解曲线。每个反应设3次生物学重复，2个技术重复，最后采用2-∆C T 或2-∆∆C T法[19]分析结果。
2 结果与分析
2.1 CsdMTase家族基因鉴定及理化分析
基于同源分析，从舒茶早基因组中鉴定出4个CsdMTase基因（CSS0047502.1、TEA031023.1、TEA022110.1、TEA033283.1），经过NCBI-blast与其他物种dMTase蛋白序列比对，将4个CsdMTase基因分别命名为CsDMEa、CsDMEb、CsROS1和CsDML3基因（表2）。对鉴定出的CsdMTase基因进行了基本特征分析发现，CsdMTase基因编码的氨基酸数目从1 800至1 943个不等，平均长度约为 1 865个氨基酸；预测分子量为200.66~216.76 kDa，平均分子量约为208.49 kDa；理论pI为6.37至8.03，除CsDMEa外，其他蛋白的pI均小于7.0，为酸性蛋白；蛋白不稳定系数均大于40，表明茶树中CsdMTase蛋白
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不稳定。亲水性（GRAVY）分析显示茶树中所有的CsdMTase蛋白都是亲水性蛋白。亚细胞定位结果显示，CsdMTase蛋白均定位于细胞核中（表2）。
包装箱制作
以茶树舒茶早、龙井43和碧云的cDNA 为模板，用表1列出的荧光定量引物为模板，对茶树CsdMTases基因片段进行克隆，结果如图1所示，CsdMTases在3个茶树品种中均有条带，测序结果显示克隆得到CsdMTases基因片段与舒茶早基因序列一致，表明文中鉴定到的4个CsdMTases基因确实存在于茶树中。草莓托
2.2 CsdMTase家族基因的遗传发育树及保守
结构域
为探究茶树CsdMTase基因家族的进化关系，本研究利用拟南芥、葡萄、杨树、水稻和茶树的CsdMTase蛋白序列构建系统进化树。结果表明，植物中的dMTase基因可以分为DME和ROS两个分支。DME类基因存在于所有双子叶植物中，但在单子叶植物中不存在（图2）。葡萄和拟南芥都只有1个DME基因，而茶树和杨树中DME基因却有2个。虽然ROS 基因存在于所有研究的植物中，但ROS基因的个数在各个植物中不尽相同（1~6个），其中水稻中最多，为6个。
利用SMART对dMTase进行保守结构域分析（图2），结果表明，大多数dMTase基本包含4个共同保守结构域：ENCO3c结构域（ENCO3C domain，包含HhH-GPD domain），Perm-CXXC结构域（Permuted single zf-CXXC unit，Perm-CXXC domain），RRM_DME结构域（RR DME domain）以及FES结构域（FES domain）。前人对拟南芥的研究表明ENCO3c 结构域行使糖苷酶功能，Perm-CXXC结构域介导DNA 结合活性[18]。Perm-CXXC结构域和RRM_DME结构域是dMTase特异性结构域，这两者与ENCO3c结构域共同参与dMTase活性。因此，在我们的分析中，编码由ENCO3c结构域和DME结构域组成的蛋白
碳管炉表1 茶树CsdMTases基因家族实时荧光定量引物
Table 1 Real-time fluorescence quantitative primers of CsdMTases family genes in tea plant
基因名称引物名称引物序列扩增片段长度/bp 退火温度/℃
Gene name Primer name Primer sequence Amplified fragment length Annealing temperature
CsDMEa CsDMEa-F CAGGCCCAGAAGAGAAAAGTGTAGTGAG
192 58 CsDMEa-R TTTCTGTGTTTTCTGGTTCTGGTGTTGT
CsDMEb CsDMEb-F CAGAGATTCAGATGCTAGACCCGAGTGG
189 58 CsDMEb-R TGCCTTTTTCTGTTGCTATGCCCTTATG
CsROS1 CsROS1-F GCAACTAATGAGGTCATCAAACCA
193 58 CsROS1-R CGTTCCTGCCCAAGCCACCTATGAT
CsDML3 CsDML3-F TCCTAAGAAGCGAAAGCCACCACCTAAG
175 58 CsDML3-R AATGAATGAATCCACCCGACCACGAA
表2 茶树CsdMTases基因的基本特征
Table 2 Basic characteristics of CsdMTases in tea plant
基因名称Gene 基因组序号
Genome
氨基酸数目
纳米金粉
Amino
分子质量
Molecular
理论等电点
Theoretical
稳定系数
Instability
亲水性
GRAVY
亚细胞定位
Subcellular
name ID acids number Weight/kDa pI index localization CsDMEa TEA016970.1*/CSS0047502.1** 1 871 208.96 8.03 49.98 –0.767 Nucleus CsDMEb TEA031023.1*/CSS0002130.1** 1 943 216.76 6.87 47.51 –0.793 Nucleus CsROS1 TEA022110.1*/CSS0012668.1** 1 847 207.56 6.37 48.04 –0.73 Nucleus CsDML3 TEA033283.1*/CSS0014168.1** 1
800 200.66 6.75 44.16 –0.625 Nucleus 注：*是参考Wei等人[16]基因组；**是参考Xia等人[15]基因组
Note: * refers to the genome of Wei et al[16]. ** refers to the genome of Xia et al[15]
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