一株防治蔬菜多种病害的非洲哈茨木霉菌及其应用

1.本发明属于生物防治技术领域，涉及一株防治蔬菜多种病害的非洲哈茨木霉菌及其应用。

背景技术：

2.化学农药长期大量不合理的使用引起了农药残留、环境污染、病虫抗药性增强等诸多问题，破坏了农业生态系统的自然平衡。生物农药研发及生防技术推广应用已成为农作物病虫害防治中的主要内容。蔬菜的生产过程中化肥农药的过量使用，使得蔬菜土传病害逐渐加重，蔬菜产量下降严重。
3.木霉属(trichodermapers.)真菌在世界范围内分布广泛，其既是土壤微生物的重要落之一，也是一种植物内生真菌，从土壤、植物根际、茎部、叶片、种子及球茎表面、枯枝落叶腐木等植物残体以及其他真菌的子实体上等均可分离得到。现有研究资料表明，木霉菌在农业、工业、环境保护等方面有着广泛的应用价值，在农业领域的应用表现尤为突出，现已有多种木霉菌生防制剂、生物菌肥、诱抗剂、种子包衣剂等产品获得登记和商业化生产并在农业生产中发挥了重要作用，其中哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)的应用场景最为广泛。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株非洲哈茨木霉菌可以对番茄叶霉病、早疫病、芝麻斑病、枯萎病以及黄瓜枯萎病、立枯病、白粉病、霜霉病、辣椒疫病等多种病害的病原菌产生明显的抑制作用。
5.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一株防治蔬菜多种病害的非洲哈茨木霉菌，所述非洲哈茨木霉菌(trichoderma afroh arzianum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年5月26日，保藏编号为cgmcc no.22433。
6.本发明还提供了一种防治蔬菜病害的生物菌剂，所述生物菌剂成分包括非洲哈茨木霉菌或其发酵物、助剂、增效剂。
7.具体的，所述非洲哈茨木霉菌或其发酵物中有效孢子数不小于10
10
cfu/g；所述助剂包括硅藻土和麦麸中的一种或组合；所述增效剂包括壳寡糖和生化黄腐酸中的一种或组合。
8.优选的，所述生物菌剂中包括非洲哈茨木霉菌或其发酵物75％，硅藻土3～10％，麦麸10～20％，壳寡糖1～3％，生化黄腐酸1～5％。
9.优选的，所述生物菌剂中包括非洲哈茨木霉菌或其发酵物75％，硅藻土6％，麦麸12％，壳寡糖3％，生化黄腐酸4％。
10.本发明还进一步请求保护所述非洲哈茨木霉菌在防治蔬菜病害上的应用。
11.具体的，所述非洲哈茨木霉菌可用于防治由真菌病原引起的番茄叶霉病、番茄早
疫病、番茄芝麻斑病、番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、辣椒疫病。
12.通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
13.(1)所述非洲哈茨木霉菌产孢量大，在作物根际及植物体内定殖能力强，根际处菌落数量可达69.66
×
104cfu/g。
14.(2)所述非洲哈茨木霉菌通过竞争、重寄生等多种作用机制，对蔬菜土传和叶部病害多种病原菌抑制作用明显，抑菌率达93.7％。
15.(3)所述非洲哈茨木霉菌制得的生物菌剂，使用方法简单，防病增产效果显著，防效达74.2％，增产率达12.5％。
附图说明
16.图1为非洲哈茨木霉菌的分子鉴定图谱。
具体实施方式
17.下面将对本发明实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1
19.本实施例分离并鉴定出非洲哈茨木霉菌。
20.(1)木霉菌株获得：首先将采集的瓜菜植株分离样本用自来水洗净、晾去水分，再切取不同部位的分离组织为合适片段，于75％酒精中浸泡60s，然后用10％次氯酸钠溶液处理3～5min，再用75％酒精浸泡30s，经表面消毒处理的组织块用无菌水清洗3次。将清洗后的不同部位组织置于灭过菌的研钵中进行研磨，取0.2ml汁液于木霉菌选择性培养基上用涂抹棒涂抹均匀，以上操作步骤重复3次后，将培养皿倒置于25℃恒温箱中培养，待平板中出现木霉菌落时挑出，并进一步纯化，超低温保存、备用。
21.(2)木霉菌形态学分类方法鉴定：挑取每个分离样品中菌落形态差异明显的不同木霉菌株进行单孢分离后，接种到pda培养基上，25℃、黑暗条件下培养72h后，待菌落成熟时观察其外部形态、颜，并挑取制片，在光学显微镜下观察木霉菌分生孢子梗的形态特征及分生孢子的大小、形状和颜，其依据是按照rifai和bissett(1984)相继修订的木霉种分类系统、魏景超的《真菌鉴定手册》等文献的描述和检索表分类标准对各木霉菌株进行形态鉴定，明确其分类地位。
22.(3)木霉菌分子生物学方法鉴定：采用its-rdna与tef1-α、rpb2相结合的分子生物学方法进行形态相似木霉种的鉴定。利用pcr技术，扩增rdna的内转录间隔区(its)序列，使用寡核苷酸条形码程序trichokey 2.0和木霉数据库trichoblast进行序列相似性检索，比对结果中序列相似性≥99％的菌株鉴定为相同种。分子鉴定图谱如图1所示。
23.实施例2
24.本实施例制备了非洲哈茨木霉生物菌剂，具体步骤如下：
25.(1)将非洲哈茨木霉菌种接入pda培养基置于28℃生化培养箱中活化，培养3天左
右待其产生大量的分生孢子，收集得到非洲哈茨木霉扩大培养菌种。
26.(2)将200克去皮马铃薯与20克葡萄糖混合，再加入1000毫升水，调节ph值至6，配制成发酵培养液，分别装入300ml三角瓶中，每瓶的装液量为150ml。在121℃下灭菌30分钟后，再将非洲哈茨木霉扩大培养菌种打成5mm的菌块并接种于150ml培养液中，在26℃、160r/min条件下振荡培养5天左右，得到非洲哈茨木霉种子发酵液。
27.(3)将麦麸、玉米粉、粗糠与水以重量比计为6:13:16:65混合后，在121℃条件下灭菌40分钟，得到固体发酵培养基，再将步骤2得到的非洲哈茨木霉种子发酵液与固体发酵培养基按1:10的比例混合。搅拌均匀后用灭菌纸覆盖，置于温度为25℃、相对湿度为85％以上的人工气候箱内培养5天，期间搅拌2次，使绿菌物均匀布满固物。发酵完毕后将其在32℃的条件下干燥，得到非洲哈茨木霉菌发酵物，将其置于冷凉处保存备用。
28.(4)将非洲哈茨木霉菌发酵物与麦麸分别用超细破碎机粉碎，过100目筛后，与硅藻土、壳寡糖、生化黄腐酸以重量比计为75:12:6:3:4干混，搅拌均匀充分混合后得到绿粉状物，测定其分生孢子含量在10
10
个/克以上，得到非洲哈茨木霉生物菌剂。
29.实施例3
30.本实施例测定了非洲哈茨木霉菌对多种病原菌的室内拮抗作用。
31.以番茄芝麻斑病菌、早疫病菌、番茄叶霉病菌、辣椒疫病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌和黄瓜立枯病菌等7种病原菌为靶标菌，过pda平板培养基中心点划一道直线，在中心两侧等距离处，分别接种病原菌和非洲哈茨木霉菌。设立对照组(ck)：在pda平板培养基中心点划一道直线，在中心只接种病原真菌。将实验组与对照组放于28℃恒温培养箱中培养5d观测其拮抗作用，分别用直尺测量实验组和对照组病原菌菌落半径，并计算抑菌率。
32.抑菌率(％)＝[(r－d)/r]
×
100％，其中，r为对照组中接种的病原菌菌落平均生长半径(cm)，d为对峙处理组中接种的病原菌菌块与非洲哈茨木霉菌接触处的相向距离(cm)。
[0033]
表1非洲哈茨木霉菌对蔬菜叶部多种病害病原菌的室内拮抗作用测定
[0034][0035]
表2非洲哈茨木霉菌对蔬菜多种土传病害病原菌的室内拮抗作用测定
[0036][0037]
由表1、表2可见，非洲哈茨木霉菌对于蔬菜的7种病害病原菌拮抗作用显著，抑菌率达88.3％～93.7％，具有良好的抑菌广谱性。
[0038]
实施例4
[0039]
本实施例测试了不同方法下非洲哈茨木霉菌对于黄瓜霜霉病和白粉病的抑制作用。
[0040]
非洲哈茨木霉菌发酵液的制备：在300ml的三角瓶中装入150ml灭过菌的pd培养液，然后接种活化过的非洲哈茨木霉菌碟，于26℃、160r
·
min-1
的条件下振荡培养5天后，得到非洲哈茨木霉菌发酵液，用灭菌水将其浓度稀释为108cfu
·
ml-1
后保存备用。
[0041]
(1)采用抑制孢子(囊)萌发法测定非洲哈茨木霉菌对黄瓜霜霉和白粉病菌孢子囊萌发的抑制作用。
[0042]
从田间采集黄瓜病叶，用灭菌水洗去原有孢子(囊)，保湿24h后，用毛笔轻轻将病斑处新产生的病原孢子(囊)刷入稀释后的非洲哈茨木霉菌发酵液中，配制成病菌孢子(囊)菌悬液，并设立灭菌水对照组。用悬滴法测定孢子萌发情况，于22℃下培养36h，在显微镜下检查孢子(囊)萌发或存活情况，并按照下面公式计算抑制率：
[0043]
抑制率(％)＝(对照萌发率-实验萌发率)/对照萌发率
×
100％
[0044]
(2)采用叶盘接种法测定非洲哈茨木霉菌对黄瓜霜霉和白粉病的抑制作用。按照上述相同方法分别制备非洲哈茨木霉菌发酵液和病原菌孢子(囊)悬浮液，并设灭菌水对照组。将非洲哈茨木霉菌发酵液加入平铺滤纸的培养皿中，用打孔器在健康叶片叶脉间打孔制成直径为1cm的叶盘，分别将其平置于含有非洲哈茨木霉发酵液的滤纸上，每皿放30片叶盘。再接种病菌孢子(囊)悬浮液10ul于叶盘中央，置于22℃的人工气候箱内培养7天后，根据病斑面积占叶盘面积的百分比划分病级，并计算病情指数和防效。
[0045]
(3)采用离体叶片法测定非洲哈茨木霉菌对黄瓜霜霉和白粉病的抑制作用。选取生长一致的健康黄瓜叶片，用无菌水冲洗干净后，用脱脂棉包住叶柄，将其置于垫有湿润滤纸的培养皿中，共10个培养皿，每个培养皿内放置1枚叶片。将配制好的病菌孢子(囊)悬浮液喷布于叶片(霜霉背面，白粉正面)；暗培养24h后喷布非洲哈茨木霉菌悬液，并用封口膜密封，以灭菌水代替木霉菌悬液喷布叶片表面作为对照，置于22℃光照12h，黑暗12h的光周期内培养7天后，待对照叶片充分发病后进行病情调查，并计算病情指数和防效。
[0046]
表3采用孢子(囊)萌发法测定非洲哈茨木霉菌对黄瓜霜霉和白粉病菌孢子囊萌发抑制作用
[0047][0048]
表4采用不同方法测定非洲哈茨木霉菌对黄瓜霜霉和白粉病的抑制作用
[0049]
[0050]
由表3、4可见，非洲哈茨木霉菌可致使病原菌孢子(囊)萌发率降低，部分孢子(囊)、菌丝等变得畸形、萎缩或坏死，抑制率达90.7％以上；利用叶盘法和离体叶片法测得非洲哈茨木霉菌对两种病害均有很好的抑制作用，相对防效可达81.5％～93.3％。
[0051]
实施例5
[0052]
本实施例测定了非洲哈茨木霉菌的定殖能力。
[0053]
采集蔬菜连作土壤，利用盆栽试验在黄瓜苗和番茄苗移栽前用非洲哈茨木霉菌剂沾根，移栽后正常管理。15天时用100倍液菌剂灌根1次，30d时挖出植株分别取蔬菜苗根际、非根际土壤和植株的不同组织，利用选择性培养基进行木霉菌数量测定，所得结果如表5所示。所用非洲哈茨木霉菌剂的制备参见实施例2。
[0054]
表5非洲哈茨木霉菌在蔬菜植株体和土壤中的菌落数量(104cfu/g)
[0055][0056][0057]
由表5可知，非洲哈茨木霉菌剂在蔬菜植株体内和土壤中定殖能力较强，r/s比值为5.51～6.01，其中木霉数量比较：根部》叶片》茎基部。
[0058]
实施例6
[0059]
本实施例测定了非洲哈茨木霉菌的田间防治效果。所用非洲哈茨木霉菌剂的制备参见实施例2。
[0060]
田间试验采用沾根和喷施相结合的方式，以施用非洲哈茨木霉菌剂作为实验组，每小区种植番茄苗90株，每组设立三个小区共计种植270株，并设立未施木霉菌剂作为对照组。在番茄苗移栽定植时用非洲哈茨木霉菌剂的100倍稀释液沾根，10天后开始灌根，每隔10天灌根1次，连续灌根3次，每株番茄苗灌溉200ml非洲哈茨木霉菌剂的100倍稀释液。在番茄生育期内定期观察枯萎病发生情况，生长中前期测定番茄各项生长指标，生育中期开始测定试验小区和对照区番茄累计产量，并计算其枯萎病发病率、防效和增产效果。
[0061]
表6非洲哈茨木霉菌剂对露地番茄生长指标、枯萎病防控及产量的影响
[0062][0063]
由表6可见，通过对番茄苗沾根和多次喷施的方式相结合施用非洲哈茨木霉菌剂后，番茄植株表现出了明显的防病促生效果，对番茄枯萎病田间防效达73.9％，增产率12.5％，且番茄早疫病等其他叶部病害发病均较轻。
[0064]
温棚试验采用沾根和喷施相结合的方式，以施用非洲哈茨木霉菌剂作为实验组，每小区种植黄瓜苗5垄，每组设立三个小区共计种植15垄，并设立未施木霉菌剂作为对照组。在黄瓜苗移栽定植时用非洲哈茨木霉菌剂的100倍稀释液沾根，10天后开始灌根，每隔10天灌根1次，连续灌根3次，每株黄瓜苗灌溉200ml非洲哈茨木霉菌剂的100倍稀释液。黄瓜生育期内定期观察枯萎病发生情况，生长中前期测定黄瓜各项生长指标，生育中期开始测定试验小区和对照区黄瓜累计产量，并计算黄瓜枯萎病发病率、防效和增产效果。
[0065]
表7非洲哈茨木霉菌剂对设施黄瓜枯萎病田间效果评价
[0066][0067]
由表7可见，施用非洲哈茨木霉菌剂后，黄瓜植株表现出了明显的促生长作用，尤其是株高；枯萎病发生较轻，田间防效达74.2％，增产率达11.46％。
[0068]
田间试验采用喷施方法进行施药防控番茄和黄瓜叶部病害，以喷施非洲哈茨木霉菌剂作为实验组，每小区面积30m2，每组设立三个小区共计面积90m2，并设立未施木霉菌剂作为对照组。在蔬菜发病初期连续喷施非洲哈茨木霉菌剂的100倍稀释液3次，每7天喷1次，依据不同病害病叶片受害分级标准，调查其病情指数，并计算防效。
[0069]
表8非洲哈茨木霉菌剂对蔬菜叶部病害的田间效果评价
[0070][0071]
由表8可见，在蔬菜发病初期连续喷施非洲哈茨木霉菌剂3次后，对番茄、黄瓜叶部多种病害表现出了明显的效果，田间防效达67.9％～70.3％。
[0072]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验的情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：

1.一株防治蔬菜多种病害的非洲哈茨木霉菌，其特征在于，所述非洲哈茨木霉菌(trichoderma afroharzianum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年5月26日，保藏编号为cgmcc no.22433。2.一种防治蔬菜病害的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂成分包括如权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌或其发酵物、助剂、增效剂。3.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，所述非洲哈茨木霉菌或其发酵物中有效孢子数不小于10
10
cfu/g。4.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，所述助剂包括硅藻土和麦麸中的一种或组合。5.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，所述增效剂包括壳寡糖和生化黄腐酸中的一种或组合。6.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂中包括非洲哈茨木霉菌或其发酵物75％，硅藻土3～10％，麦麸10～20％，壳寡糖1～3％，生化黄腐酸1～5％。7.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂中包括非洲哈茨木霉菌或其发酵物75％，硅藻土6％，麦麸12％，壳寡糖3％，生化黄腐酸4％。8.如权利要求1～7任一所述的非洲哈茨木霉菌在防治蔬菜病害上的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述非洲哈茨木霉菌用于防治由真菌病原引起的蔬菜病害。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述非洲哈茨木霉菌用于防治番茄叶霉病、番茄早疫病、番茄芝麻斑病、番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、辣椒疫病。

技术总结

本发明公开了一株防治蔬菜多种病害的非洲哈茨木霉菌，该非洲哈茨木霉菌具有产孢量大、定殖能力强的性质，对番茄叶霉病、早疫病、芝麻斑病和枯萎病以及黄瓜枯萎病、立枯病、白粉病、霜霉病、辣椒疫病等多种病害的病原菌抑菌作用明显，田间防病促生效果显著，在植株体内与寄主可形成共生关系，稳定性强。施用后可有效降低化学农药使用量和植株抗药性，植株生育期延长，达到提质增效的效果，促进蔬菜产业绿发展。绿发展。绿发展。