大鼠唾液收集法

方法一：外科手术收集唾液

1　材料与方法1. 1　微型Lashley吸盘法收集大鼠腮腺唾液见图1　Wistar大鼠,体重200～ 300 g,腹腔注射盐酸麻醉(100 mg /kg),仰卧位固定在自制手术台上,上开口器,将灯光(60W)照向大鼠颌下腺区域的表面皮肤,半导体除湿用弯纹式钳撑开舌根部咽腔,用干棉球擦干咽部,光线透过咽腔表面皮肤,直视即可清楚看到声门,声带随呼吸开合运动。直视下,在大鼠吸气时迅速将塑料导管插入气管。(塑料导管外径1. 78mm、内径1. 18 mm、长55 mm,前端呈斜坡形,内置一铜芯,其前端较塑料导管短约2. 0 mm,以避免铜芯损伤大鼠气管)塑料导管前端可以用手术缝合线结扎固定在上颌切牙上,可以避免导管脱出。用一小棉球擦干一侧的颊黏膜,用手轻轻按摩大鼠唾液腺区,在颊黏膜腮腺导管开口处可见有一滴唾液,打开真空泵,将微型Lashley吸盘置于其上,即可将吸盘固定在颊黏膜上。颈部皮下注射0. 2%毛果芸香碱(2 mg /kg),大约3 min左右,唾液开始分泌,弃掉开始几滴唾液,将唾液收集在已称重的eppendorf管内,收集15min。在收集唾液的过程中,应保持大鼠的头部应略低一些,避免发生窒息。

1. 2　插管法收集大鼠颌下腺唾液见图2　

1)皮下注射毛果芸香碱,收集1 h。大鼠麻醉固定后,用止血钳夹持舌尖,将舌牵出,略偏向一侧。

在口底中线两侧,下中切牙舌侧约4～ 5 mm可见红的颌下腺导管乳头,其腹侧为导管口,实际上肉眼看不到。将PE10塑料管(长约4 cm)一端剪成斜坡形,用镊子夹持在距插入端约2. 0 mm处,拨动颌下腺导管乳头附近数次,led斗胆灯使导管口打开,在颌下腺导管乳头的腹侧轻轻插入导管约2. 0 mm。切开气管,同上颈部皮下注射0. 2%毛果芸香碱刺激唾液分泌,弃掉开始几滴唾液,将唾液收集在已称重的eppendorf管内,收集时间1 h。

2)颌下腺导管逆行注射毛果芸香碱,收集15 min。(1)导管的拉制:取约8 cm长PE10塑料管,双手的拇指和食指持导管的两端,将PE10拉直,但不要太紧,将PE10塑料管的中间部分在酒精灯火焰上快速通过或距火焰15 cm处将其中间短时间加热变软,在其即将融化时移开,两手慢慢向两端拉,几秒钟冷却后,从中间切开即制成两个一端更细的导管。(2)插管收集唾液:4只Wistar大鼠,麻醉、固定同上,导管的细端颌下腺导管口内插管成功后,在导管口处滴一滴组织胶密封(502胶高压脉冲电容器)。导管的粗端连接微量注射器,通过每侧导管逆行注射0. 5%毛果芸香碱25μ L,保持15 s后再移走注射器,收集蒸压加气块15 min[5]。

方法二：棉球擦拭收集唾液法

2.1 分组与给药将兔随机分为5组，分别为:空白对照组(0. 5 % CMC-Na )，六味地黄丸组(

0. 21g/kg)，生津润燥颗粒高剂量组(11. 62 g生药//kg),生津润燥颗粒中剂量组(3. 87 g生药/kg)，生津润燥颗粒低剂量组(1. 29 g生药/kg)，每组8只，雌雄各4只。灌胃给药，每日一次，连续给药6d，试验前12 h禁食，不禁水，于末次给药后30 min，静脉注射乌拉坦生理盐水液(6. 5% ,10 mL/kg) ,10 min后测量兔的唾液及泪液分泌量，每10 min测量一次，连续测量3次。

2.2 唾液量及泪液量的测定方法将兔放人兔箱内固定，用止血钳将重量相近的干棉球验光组合(100 11.5)mg放人兔口腔，上、下、左、右各擦拭一遍，间隔5 min，再以同样的方式将口腔擦拭一遍，然后称质量，减去棉球干质量(200 mg)，合并2次质量为10min内家兔的唾液量。同时将100 x 5 m耐的滤纸条贴在兔的右眼下眼睑，10 min，测量湿滤纸条长度，每10 min更换一片滤纸条，连续测量3次。随后皮下注射硫酸阿托品(0. 5 mg/kg ) , 15 min后测量注射阿托品的兔的唾液量及泪液量(测量泪液量时滤纸条贴于兔的左眼下眼睑)。

结果：

电梯箱

3. 1生津润燥颗粒对家兔唾液分泌量的影响研究结果发现，在给药后40 min时的高、中剂量组，50min时的高、中、低剂量组，60 min时的高、低剂量组家兔唾液分泌量均显著增

加;同时高、中剂量还可拮抗注射阿托品所导致的唾液分泌减少，与对照组比较差异均有显著统计学意义(见表1 ,2 )。

方法三：饮水量法（非唾液收集法）

将大鼠随机分为六组，空白对照组（等容积0.5% CMC-Na)，模型对照组(等容积0. 5% CMC-Na )，强的松组(0. 005 4 g/kg )，生津润燥颗粒高剂量组( 22. 41 g生药/kg)，生津润燥颗粒中剂量组(7. 47 g生药/kg)，生津润燥颗粒低剂量组(2, 49 g生药/kg)。

将液体石蜡和羊毛脂按3:2的比例混合，高压灭菌，每1 mL加人卡介苗7. 5 mg，研磨均匀，即得弗氏佐剂。另取SD大鼠领下腺组织，加适量生理盐水匀浆，离心机离心15 min (

3 000 r/min )，收集上清液，即蛋白抗原液。将制备好的蛋白抗原液用生理盐水稀释成1 600ug/mL，与等体积的弗氏佐剂混合，即为注射用抗原液(800ug/mL )。并多点注射于大鼠的背部皮下，每只0. 5 mL。同时，背部皮下注射白喉一百日咳一破伤风三联疫苗0. 2 mL/只。空白对照组只注射生理盐水。首次注射抗原后的5,10,15和20 d分别加强注射一次。各组于末次注射抗原后次日开始给药。造模及给药时间共计9周。测定各组大鼠的每日饮水量，于实验结束后，眼眶取血，制备血清，按照试剂盒说明书检测血清IgG , Fas , Fas-L , TNF-a , IL-2 R水平，并取领下腺进行组织学病理检查。

结果：