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环球中医药2021年9月第14卷第9期 Global Traditional Chinese Medicine,September 2021,Vol.14,No.9
㊃基础研究㊃
基金项目：国家自然科学基金(81530101㊁81973613)；上海市青年科技启明星计划(19QA1408900)
作者单位:201203 上海中医药大学交叉科学研究院[高思琦(博士研究生)㊁肖准(博士研究生)㊁王晓柠㊁刘伟㊁刘平]；上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所肝肾疾病病证教育部重点实验室上海市中医临床重点实验室[高思琦(博士研究生)㊁肖准(博士研究生)㊁王晓柠㊁刘伟㊁陈佳美㊁刘平]
作者简介：高思琦(1994-),2018级在读博士研究生㊂研究方向：中医药防治慢性肝病㊂E⁃mail:sharryco2@163
通信作者：陈佳美(1987-)，博士，副研究员㊂研究方向：中医药防治慢性肝病的临床与基础研究㊂E⁃mail:
cjm0102@126
高思琦 肖准 王晓柠 刘伟 陈佳美 刘平
【摘要】 目的 观察一贯煎对野百合碱诱导的急性肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal
obstruction syndrome,HSOS)大鼠模型的干预作用并探析其部分作用机制㊂方法 24只雄性SD 大鼠随机分为正常对照组㊁模型组及一贯煎组，每组8只㊂采用野百合碱90mg /kg 灌胃，制备大鼠HSOS 模型㊂一贯煎组大鼠在造模后6小时及30小时予以浓度为1.139g /kg 一贯煎灌胃，造模48小时后处死取材㊂检测血清丙氨酸氨基转移酶㊁天冬氨酸氨基转移酶活性，采用扫描电镜及苏木素 伊红染观察肝组织病理变化，微板法检测肝组织匀浆谷胱甘肽S 转移酶㊁总谷胱甘肽㊁丙二醛含量,TUNEL 法检测细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测肝组织肿瘤坏死因子α㊁血红加氧酶1㊁炎症小体NLRP3及白介素1β的mRNA 表达，免疫组化法检测肝组织巨噬细胞标志物F4/80表达,Western Blot 法检测肝组织肿瘤坏死因子α㊁细胞凋亡相关B 淋巴细胞瘤⁃2(B⁃cell lymphoma⁃2,Bcl2)和Bcl⁃2相关X 蛋白(Bcl⁃2associated X,Bax)的蛋白表达㊂结果 (1)与正常对照组相比，模型组血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著升高(P <0.01)，苏木素 伊红染可见大量肝细胞坏死㊁炎性细胞浸润及红细胞淤积，电镜观察可见肝血窦扩张，窦内皮窗孔扩大, 筛状”结构消失，甚至脱落,Disse 空间暴露㊂(2)模型组肝组织丙二醛含量显著增高(P <0.05)，巨噬细胞标志物F4/80及肿瘤
坏死因子α的蛋白表达显著增加(P <0.01)，肿瘤坏死因子α㊁血红加氧酶⁃1㊁炎症小体及白介素1β的mRNA 表达显著增加(P <0.01)，而一贯煎用药可降低肝组织丙二醛含量(P <0.05)，下调F4/80及肿瘤坏死因子α蛋白表达(P <0.01)及肿瘤坏死因子α㊁血红加氧酶1(P <0.001)㊁炎症小体及白介素1β(P <0.05)的mRNA 表达㊂(3)TUNEL 检测模型组肝组织凋亡细
胞显著增加,Bcl2/Bax 比值显著下降(P <0.05)㊂结论 一贯煎可有效改善野百合碱诱导的急性肝窦阻塞综合征，可显著降低模型大鼠血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶的活性，改善肝组织坏死及肝窦内皮损伤，并减少肝组织细胞凋亡㊂其作用机制可能与抗过氧化㊁抗炎性损伤㊁抑制肝细胞凋亡有关㊂
【关键词】 一贯煎; 肝窦阻塞综合征; 野百合碱; 抗氧化; 抗炎; 抗凋亡; 效应机制【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2021.09.003Research on the effect andmechanism of Yiguanjian on hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats
GAO Siqi ,XIAO Zhun ,WANG Xiaoning ,LIU Wei ,CHEN Jiamei ,LIU Ping
Institute of Interdisciplinary Science ,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine ,Shanghai 201203,China
Corresponding author :CHEN Jiamei ,E⁃mail :cjm0102@126
【Abstract 】 Objective To observe the intervention effect of Yiguanjian on monocrotaline⁃induced
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acute hepatic sinusoidal obstruction syndrome(HSOS)in rats and to explore its mechanism.Methods
Twenty⁃four male SD rats were randomly divided into the control group,the model group and the Yiguanjian
treated group(n=8).90mg/kg body weight of monocrotaline were administered intragastrically to prepare
rat HSOS model.Rats in the Yiguanjian treated group were administered intragastrically with10ml/kg
body weight6hours or30hours after treated with monocrotaline respectively,and consistency of decoction
is1.139g/kg.All the rats were sacrificed after48hours.The serum and liver tissue samples were
内病外治collected and serum liver function was measured.Scanning electron microscope and HE staining were used
to observe liver pathology.The activity of glutathione S⁃transferase,total superoxide dismutase and the
content of malondialdehyde in liver tissue homogenates were detected by microplate method.Cell apoptosis
was detected by TUNEL method,the mRNA expressions of TNF⁃α,HO⁃1,NLRP3,IL⁃1βin liver tissues
were detected by qRT⁃PCR.F4/80expressions in liver tissues were detected by immunohistochemistry and
the expressions of TNF⁃α,Bcl2and Bax proteins in liver tissues were detected by Western Blot.Results
(1)Compared with the control group,the serum glutamic pyruvic transaminase and glutamic oxaloacetic transaminase activities in the model group were significantly increased(P<0.01).A large amount of hepatocyte necrosis,inflammatory cells infiltration and erythrocyte stasis were observed b
y HE staining.
Electron microscopy showed that hepatic sinus dilatation and endothelial window openings.The
ethmoidal”structure of hepatic sinuses disappeared or even fell off,and the Disse space was exposed.
(2)The MDA content,the protein expressions of F4/80and TNF⁃α,and the mRNA expressions of
TNF⁃α,HO⁃1,NLRP3,and IL⁃1βof liver tissue in the model group was increased significantly
(P<0.01),while Yiguanjian could significantly reduce the MDA content(P<0.05),and down⁃regulate
the expressions of F4/80,TNF⁃α(P<0.01),HO⁃1(P<0.001),NLRP3(P<0.01)and IL⁃1β
(P<0.05).(3)The TUNEL positive cells were increased significantly in the model group,Bcl2/Bax ratio decreased significantly(P<0.05).Conclusion Yiguanjian can effectively improve monocrotaline⁃induced
acute HSOS,it can significantly reduce the activity of ALT and AST in serum of model rats,reduce liver
necrosis and sinusoidal endothelial damage,and reduce liver tissue cell apoptosis.Its mechanism may be
related to inhibit oxidative stress and inflammatory injury,and reduce cell apoptosis.
【Key words】 Yiguanjian; Sinusoidal obstruction syndrome; Monocrotaline; Anti⁃oxidation;
Anti⁃inflammatory; Anti⁃apoptosis; Effect mechanism
肝窦阻塞综合征(hepatic sinus obstruction syndrome,HSOS)，即肝小静脉闭塞性阻塞(hepatic veno⁃occlusive disease,HVOD)，是由肝窦内皮细胞损伤导致的肝窦流出道梗阻的肝内门静脉高压综合征，可进展为多器官衰竭，其死亡率极高[1]㊂在中国，摄入含有天然毒性吡咯里西啶生物碱的土三七是导致HSOS的主要原因[2⁃4]㊂目前，临床尚无有效的药物，现行可用的仅有去纤苷，在欧洲被批准用于造血干细胞移植后的重症HSOS，但其具有一定局限性[5]㊂现有研究表明，中药的一些活性成分具有改善HSOS的作用，如芝麻酚㊁川芎嗪等[6⁃7]，其主要作用机制可能与抗炎抗氧化相关㊂中医名方一贯煎出自清代医家魏之秀的‘续名医类案“，由生地黄㊁麦冬㊁北沙参㊁枸杞㊁当归㊁川楝子六味中药组成，主治 胁痛，吞酸，吐酸，疝瘕，一切肝病”，有滋阴养肝之效㊂现代研究表明，一贯煎具有良好的抗肝纤维化作用，其主要作用机制与抗炎抗氧化，抗肝细胞损伤，改善肝窦毛细血管化以及抑制肝星状细胞活化有关[8⁃9]㊂然而一贯煎对于HSOS的干预作用尚未见报道㊂本研
究探究中药复方一贯煎对野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的急性HSOS大鼠模型
的干预作用，观察氧化应激㊁炎症及细胞凋亡相关指标并探讨其可能的作用机制㊂
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级雄性Sprague⁃Dawley(SD)大鼠，体质量180~200g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司动物中心㊂动物许可证编号:XYXK(沪)2020⁃0009㊂饲养于上海中医药大学实验动物中心，自由饮食饮水，恒温恒湿，昼夜交替㊂动物实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准(PZSHUTCM190315007)㊂
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1.2 药物㊁试剂和仪器
一贯煎由生地黄(18g)㊁麦冬(10g)㊁北沙参(10g)㊁枸杞子(12g)㊁当归(10g)㊁川楝子(4.5g)六味中药组成，浸膏粉(含生药3.021g/g)由上海中医药大学附属曙光医院制剂中心(国家中医药管理局三级实验室)一次性制备㊂
测井车
野百合碱购自Sigma公司(C2401)；丙氨酸/天冬氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase/aspartate aminotransferase,ALT/AST)㊁总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T⁃SOD)㊁丙二醛(malon⁃dialdehyde,MDA)㊁谷胱甘肽⁃S⁃转移酶(glutathione s⁃transferase,GST)活性检测以及苏木素 伊红(hematoxylin⁃eosin staining,HE)染的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂盒购自基因科技(GK500705，批号:2018082901);TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显法)购自碧云天(C1091，批号:0318********)；逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司;BCA蛋白质测定试剂盒购自Thermo 公司；甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶(glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自Proteintech公司㊂PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1㊂
F200PRO型酶标仪(瑞士Tecan集团公司); VIIA7型PCR仪(美国ABI公司);041BR127719型电泳仪及转膜仪(美国Bio⁃Rad公司);OdysseyCLX 双红外荧光成像系统(美国LI⁃CORBiosciences公司);SCN400型数据切片扫描机(德国Leica公司);QUANTA FEG250环境扫描电子显微镜(荷兰飞利浦公司生产)㊂
马丽散1.3 动物模型制备与分组
将SD大鼠适应性饲养后根据体质量随机分为正常对照组㊁模型组及一贯煎组，每组8只，模型组及一贯煎组大鼠采用90mg/kg MCT灌胃制备HSOS模型，正常对照组同时灌胃等量的蒸馏水㊂造模后6小时㊁30小时对一贯煎组大鼠予一贯煎(剂量为1.139g/kg)灌胃两次，模型组灌胃等量的蒸馏水，灌胃药
液量为10mL/kg㊂48小时后，各组均未见死亡，以3%钠腹腔注射麻醉后处死取材，采集血液(静置3小时后，转速1000g/分钟，离心15分钟获取血清)和肝组织样本用于后续实验㊂1.4 血清生化分析及组织病理学观察
将血清样本室温解冻，振荡混匀，按照试剂盒
说明书步骤检测ALT和AST活性㊂肝组织病理学
样品取肝脏大叶同一部位肝组织，置于10%中性甲
醛缓冲液固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片, HE染，封片，使用数据切片扫描机自动扫描，观察肝细胞损伤㊁炎症反应程度等㊂扫描电子显微镜
观察样品制备：先用PBS通过大鼠腹主动脉灌注,
后用含有2.5%戊二醛的固定液灌注㊁取样，样本处
理后用QUANTA FEG250环境扫描电子显微镜
观察㊂
1.5 MDA含量㊁T⁃SOD及GST活性检测
在预冷的PBS中匀浆肝组织，采用MDA试剂
盒测定㊂BCA法检测肝组织蛋白质浓度,MDA量表
示为nmol/mg蛋白㊂肝脏T⁃SOD㊁GST活性检测同
上，均根据试剂盒说明书测定㊂
1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real⁃time PCR)检测mRNA表达
称取肝组织，加入Trizol试剂对组织总RNA进
行提取后，使用逆转录试剂盒对总RNA进行逆转
录，得到cDNA㊂用Real⁃time PCR检测肝组织mRNA的表达水平，采用2-ΔΔCt法计算各mRNA的表达量㊂
1.7 蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测肝组
织蛋白表达
称取肝组织，加RIPA蛋白裂解液后，使用全
自动研磨仪匀浆，提取上清液,BCA蛋白定量并加
上样缓冲液㊂制备10%聚丙烯酰胺凝胶进行电
泳，转膜，膜封闭及抗体反应，使用odydssey红外
图像系统检测，采用Image J软件分析各条带灰
度值㊂拉丝模
1.8 免疫组化染
肝组织石蜡切片常规脱蜡复水，置于柠檬酸缓
冲液(柠檬酸三钠3g+柠檬酸0.4g，定容至1000 mL)中，微波炉高温抗原修复，自然冷却至室温㊂将切片取出浸泡于3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，室温避光孵育10分钟，滴加10%山羊血清封闭30分钟，滴加一抗,4℃过夜㊂次日使用免疫组化试剂盒孵育二抗,37℃,30分钟,DAB显，然后用苏木素染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，显微镜下观察㊂
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表1 引物序列
基因名称Forward(5’to3’)Reverse(3’to5’)TNF⁃αTGGGCTCCCTCTCATCAGTTCC GCTCCTCCGCTTGGTGGTTTG IL⁃1βTGACAGGCAACCACTTACC
CCCATACACACGGACAACT
HO⁃1
CACACCAGCCACACAGCACTAC CTAAGAGGTCACCCAGGTAGCG NLRP3
CCTGGTCTGCTGGATTGTGTGC AGTCGTGGTCTTGGAGGTCTGG 1.9 TUNEL 法检测肝组织细胞凋亡根据碧云天TUNEL 试剂盒说明书操作㊂1.10 统计学分析
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均值±标准差(x ±s )表示，组间多重比较分析，若方差齐采用单因素方差分析结合LSD 法进行组间的两两比较，方差不齐则采用Kruskal⁃Wallis 检验,P <0.05认为差异具有统计学意义㊂2 结果
2.1 一贯煎对MCT 诱导的大鼠HSOS 病理学变化及干预作用
模型组血清ALT 及AST 活性较正常对照组显著升高(P <0.01)，一贯煎组可显著降低MCT 诱导的血清ALT㊁AST 活性(P <0.05)㊂见表2㊂
肝组织HE 染可见正常组肝脏组织结构正常，肝板排列整齐，汇管区未见扩大及炎症细胞浸润㊂而模型组则见肝脏结构破坏严重，肝细胞大面积坏死，汇管区周围炎性细胞浸润，肝窦内红细胞大量聚集, 瘀血”现象明显，一贯煎组肝组织损伤明显减轻㊂见图1㊂
表2 各组HSOS 大鼠血清ALT㊁AST 活性比较(x ±s )
组别鼠只ALT(U /L)AST(U /L)正常对照组821.18±4.8511.10±5.43模型组8265.73±166.19a 253.79±94.59a 一贯煎组
8
136.77±110.01b
121.31±91.12c
中波塔注：与正常组比较,a P <0.01；与模型组比较,b P <0.05,c P <0.
01㊂
图1 各组HSOS 大鼠肝组织HE 染结果(×200)
肝组织扫描电镜结果可见，与正常对照组相比，模型组肝窦内皮呈现连续性破坏，肝窦内皮窗
孔扩大, 筛状”结构消失，甚至脱落，使Disse 空间暴露；而一贯煎组的肝窦内皮损伤病变明显改善，表明一贯煎可显著改善MCT 诱导的HSOS 大鼠的肝窦内皮细胞损伤㊁肝细胞坏死等病理改变㊂见图
2㊂
图2 各组HSOS 大鼠肝组织扫描电镜结果(×20,000)
2.2 一贯煎对MCT 诱导的HSOS 大鼠肝脏氧化应激及炎性因子的影响
与正常对照组相比，模型组肝组织GST 活性和MDA 含量显著升高(P <0.05)，一贯煎组肝组织GST 活性较模型组有所降低,MDA 较模型组显著降低(P <0.05)㊂模型组T⁃SOD 活性较正常对照组显著降低(P <0.01)；与模型组相比，一贯煎组肝组织T⁃SOD 有升高的趋势㊂见表3㊂
表3 各组HSOS 大鼠肝组织GST 活性㊁T⁃SOD 活性和MDA 含量比较(x ±s )
组别
鼠只
GST(U /mg)T⁃SOD(U /mg)MDA(nmol /mg)正常对照组8158.16±32.39 4.28±0.93 2.64±0.89模型组8232.50±50.52a 2.55±0.47b 5.70±2.32a 一贯煎组
喇叭网罩
8
196.00±15.88c
2.99±0.53
2.89±0.83c
注：与正常组比较,a P <0.05,b P <0.01；与模型组比较,c P <0.01㊂
与正常对照组相比，模型组肝组织炎症相关因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,
TNF⁃α)㊁白细胞介素1β(interleukin⁃1β,IL⁃1β)㊁血红加氧酶(heme oxygenase 1,HO⁃1)及炎症小体
(nod⁃like receptor protein 3,NLRP3)的mRNA 表达显著增加(P <0.01)，而一贯煎干预组肝组织中这些基因的表达较模型组显著降低(IL⁃1β:P <0.05,HO⁃1:P <0.01)㊂见表4㊂
1570 环球中医药2021年9月第14卷第9期 Global Traditional Chinese Medicine,September2021,Vol.14,No.9表4 各组HSOS大鼠肝组织TNF⁃α㊁IL⁃1β㊁HO⁃1及NLRP3的mRNA表达比较(x±s)
组别鼠只TNF⁃αIL⁃1βHO⁃1NLRP3
正常对照组8 1.11±0.18 1.24±0.310.76±0.18 1.08±0.12
模型组8 3.87±1.60a 5.48±2.71a8.95±1.56a 2.09±0.67a
一贯煎组8 2.82±0.68 1.38±0.20b 2.11±1.45c 1.54±0.29
注：与正常组比较,a P<0.01；与模型组比较,b P<0.05,c P<0.01㊂
与正常对照组相比，模型组肝组织TNF⁃α蛋白表达显著升高(P<0.01)，而一贯煎组肝组织TNF⁃α的蛋白表达较模型组显著降低(P<0.01)㊂见图3㊁表5㊂此外，肝组织巨噬细胞标志物F4/80免疫组化染结果显示，与正常组相比，模型组F4/80的阳性面积显著增加，一贯煎干预后F4/80的阳性面积明显减少(见图4)㊂以上结果提示一贯煎可改善MCT诱导的HSOS大鼠肝脏氧化应激及炎症反应
㊂
图3 各组HSOS大鼠肝组织TNF⁃α蛋白表达
表5 各组HSOS大鼠肝组织TNF⁃α蛋白表达比较(x±s)组别鼠只TNF⁃α
正常对照组80.32±0.23
模型组8 1.26±0.26a
一贯煎组80.47±0.07b
注：与正常组比较,a P<0.01；与模型组比较,b P<0.
01㊂
图4 各组HSOS大鼠肝组织F4/80蛋白表达(×200) 2.3 一贯煎对MCT诱导的HSOS大鼠肝细胞凋亡的影响
肝组织经TUNEL染可见，正常组肝组织几乎没有TUNEL阳性表达；模型组肝组织TUNEL主要表达在肝细胞上,TUNEL阳性细胞显著增多；一贯煎组肝组织TUNEL阳性细胞数较模型组明显减少(见图5)㊂进一步检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤⁃2(B⁃cell lymphoma⁃2,Bcl2)和Bcl⁃2相关X蛋白(Bcl⁃2associated X,Bax)的表达发现，模型组肝组织Bcl2的蛋白表达及Bcl2/Bax的比值较正常组显著降低(P<0.01,P<0.05)，而一贯煎组干预后均有所提高(见图6㊁表6)，提示一贯煎可显著减轻MCT 诱导的HSOS大鼠肝细胞凋亡
㊂
图5 各组HSOS大鼠肝组织凋亡TUNEL染(
×200)
图6 各组HSOS大鼠肝组织Bcl2/Bax蛋白表达
表6 各组HSOS大鼠肝组织Bcl2/Bax蛋白表达比较(x±s)组别鼠只Bcl2Bcl2/Bax 正常对照组80.97±0.1212.59±7.42模型组80.18±0.04a0.23±0.06b
一贯煎组80.55±0.350.67±0.41注：与正常组比较,a P<0.05,b P<0.01㊂
3 讨论
HSOS作为一种肝病的危重症，常因肝肿大㊁腹水㊁黄疸㊁门静脉高压甚至严重的肝衰竭而导致死亡，其在临床上目前尚无可用的药物㊂现行可用的去纤苷，临床报道数据显示，HSOS的治愈率仅25.5%[10]㊂除去纤苷外，一些单克隆抗体㊁索拉菲尼等也具有HSOS的作用，但仍处于实验室研究阶段[11⁃14]㊂国内提出的 吡咯生物碱相关肝窦阻塞综合征诊断和专家共识意见(2017年，南京)”[15]对该病的也仅限于对症支持疗法，因而探求HSOS的有效药物具有十分重要的临床意义㊂天然产物MCT属于PAs，其代谢产物脱氢
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