护肾(Ⅲ)号胶囊中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1在大鼠体内药代动力学研究管式静态混合器
钱伟;冯星月;陈晓峰;王建平;蒋志涛;余辉
【摘 要】目的 建立超高液相谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)测定护肾(Ⅲ)号胶囊给药后大鼠血浆中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 含量的方法,并对其药代动力学特征进行研究.方法 SD大鼠灌胃护肾(Ⅲ)号胶囊 2 g/kg 后按时间点取血,以为内标,采用 UHPLC-MS/MS 测定给药不同时点血浆中三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1浓度,并用DAS2.0软件计算药代动力学参数.结果 三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的线性关系良好(r≥0.997 5);日内、日间精密度RSD均小于13.1%,准确度、回收率及稳定性符合生物样品分析要求.大鼠体内三七皂苷R1药代动力学参数:T1/2(7.86±1.69)h,Tmax(4.00±1.04)h,Cmax(0.23±0.05)mg/L;人参皂苷Rg1药代动力学参数:T1/2(4.58±0.95)h,Tmax(6.00±0.00)h,Cmax(0.32±0.03)mg/L.结论 本研究建立的UHPLC-MS/MS分析方法灵敏、准确可靠,适用于护肾(Ⅲ)号胶囊的药代动力学研究.%Objective To establish a UHPLC-MS/MS method for the determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in rat plasma after oral administration of Hushen (Ⅲ) Capsules; To study its pharmacokinetics. Methods SD rats were given Hush en (Ⅲ) Capsules 2 g/kg and then the blood was collected at time point. Digoxin was used as internal standard. The drug concentrations of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in plasma were determined by UHPLC-MS/MS. And the relative pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS2.0 software. Results The linear relationship of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 was good (r≥0.997 5). The RSD of intra-day and inter-day precision were less than 13.1%. The results of accuracy, recovery and stability met the requirements for the biology sample analysis. For notoginsenoside R1, the pharmacokinetics parameters T1/2, Tmax, Cmaxin the plasma were (7.86±1.69)h, (4.00±1.04)h, (0.23±0.05)mg/L. For ginsenoside Rg1, the pharmacokinetics parameters T1/2, Tmax, Cmaxin plasma were (4.58±0.95)h, (6.00±0.00)h, (0.32±0.03)mg/L. Conclusion The established UHPLC-MS/MS method is sensitive, accurate and reliable, and is suitable for the pharmacokinetic study of Hushen (Ⅲ) Capsules.
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【期刊名称】《中国中医药信息杂志》
【年(卷),期】2018(025)007
【总页数】4页(P71-74)
【关键词】护肾(Ⅲ)号胶囊;超高液相谱串联质谱;药代动力学
【作 者】钱伟;冯星月;陈晓峰;王建平;蒋志涛;余辉
【作者单位】南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600;南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600;南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600;南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600;南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600;南京中医药大学附属张家港医院,江苏省企业研究生工作站,江苏 张家港 215600
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
目前，血尿形成机制尚未完全阐明，通常认为与免疫炎症反应导致肾小球基底膜受损有关，
西医往往效果不佳，迁延难愈。肾性血尿属中医学“血证”范畴，中医血尿积累了丰富的临床经验，并取得了较好的疗效[1]。护肾（Ⅲ）号胶囊是张家港市中医医院复方制剂，由白茅根、三七、大黄炭组成，具有清热解毒、滋肾降火功效，临床常用于血尿为主的各种肾病。三七作为方中臣药，具有良好的止血、活血化瘀、消肿止痛作用，辅助君药白茅根血尿诸症。三七总皂苷为三七的主要有效成分，具有抗炎、增强免疫功能的作用。已有研究采用 HPLC对护肾（Ⅲ）号胶囊的有效成分进行了含量测定[2]。本研究采用高效、灵敏的超高液相谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术对护肾（Ⅲ）号胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在血浆中的含量进行分析，并对其在大鼠血浆中的药动学特征进行研究，为进一步开展护肾（Ⅲ）号胶囊临床应用研究，明确其作用机制奠定基础。
1 仪器、试药与动物
Agilent 1290超高效液相谱仪；Agilent 6430 LC-MS三重四级杆质谱仪，配有电喷雾化离子源（ESI），MassHunter谱工作站；AE240 电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷冻离心机（美国Thermo公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；Drict-Q5超纯水机（法国Millipore公司）。
三七皂苷R1对照品（纯度94%，批号110745-201318）、人参皂苷 Rg1对照品（纯度 95%，批号110703-201529）、对照品（纯度 99%，批号100015-201308），中国食品药品检定研究院；护肾（Ⅲ）号胶囊（批号170227），张家港市中医医院制剂室。
SPF级健康雄性SD大鼠8只，体质量（240±20）g，南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号SCXK（沪）2013-0006。饲养环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%，自然光照。
2 方法与结果
oltc2.1 谱及质谱检测条件
谱柱：Agilent ZOBAX SB C18柱（2.1 mm×150 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（75∶25）；流速：200 µL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 µL。离子源：ESI；离子化模式：正离子；定量模式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：400 ℃；Fragmentor及CE值：三七皂苷R1分别为300、40 V，人参皂苷Rg1分别为260、40 V，（内标）分别为270、50 V；检测对象：三七皂苷 R1 m/z 955.5→m/
z 775.5；人参皂苷 Rg1 m/z 823.5→m/z 643.5；内标m/z 803.6→m/z 283.1。各化合物质谱参数见表1。
2.2 对照品溶液与内标溶液的配制
精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1对照品适量，用甲醇溶解于 10 mL容量瓶中，制成三七皂苷R1、人参皂苷Rg1浓度分别为1.01、1.036 mg/mL的混合对照品贮备液。取上述贮备液，用甲醇稀释，制成不同浓度的对照品溶液，用于考察线性关系。精密称取对照品适量，加甲醇配制成浓度为2 µg/mL的内标溶液。对照品溶液与内标溶液均在4 ℃条件下贮藏。
表1 分析物及内标质谱参数?
2.3 给药与样品采集
SD大鼠8只，适应性饲养1周。实验前禁食12 h，自由饮水，按2 g/kg剂量灌胃给予护肾（Ⅲ）号胶囊（用0.5%CMC-Na溶解），分别于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、2、4、6、8、12、24、48 h 经大鼠眼眶静脉丛采血约 0.2 mL，置于放有肝素钠的离心管中，400
0 r/min离心10 min，吸取血浆，放入-20 ℃冰箱冷冻保存。采用DAS2.0软件对所测血药浓度-时间数据进行处理。
2.4 血浆样品的处理与分析
精密吸取血浆样品50 µL，置2 mL离心管中，精密加入内标溶液10 µL，涡旋混匀30 s，加乙腈-甲醇（1∶1）混合溶剂500 µL，沉淀蛋白，涡旋3 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，于37 ℃水浴中以氮气流吹干，残留物加甲醇-水（50∶50）溶剂100 µL复溶，涡旋混匀3 min后，12 000 r/min离心10 min，取上清液2 µL，进行UHPLC-MS/MS分析。按标准曲线法，根据峰面积比值计算血浆样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1的浓度。
2.5 方法学验证
基质特异性、灵敏度、线性、准确度、精密度、回收率、基质效应和稳定性均按 2015年版《中华人民共和国药典》关于“生物样品定量分析方法验证指导原则”进行[3-4]。
利路防水接头
2.5.1 专属性考察
保温炉
取大鼠空白血浆样品、空白血浆加混合对照品及内标溶液、大鼠给药后血浆样品适量，按“2.4”项下方法进行处理分析，进样测定，得到空白血浆、空白血浆＋混合对照品、大鼠给药后1 h血浆样品中各待测成分的提取离子流图，见图1。结果显示，护肾（Ⅲ）号胶囊中2种待测成分能与内标物完全分离，峰形良好，空白血浆在相应时间处没有出峰，无明显杂质和内源性物质的干扰，表明该血浆处理方法及测定条件专属性良好。
图1 护肾（Ⅲ）号胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 UPLC-MS/MS图注：A.空白血浆；B.空白血浆＋混合对照品；C.大鼠给药后1 h血浆
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